黃芪丹參配伍提取物經VEGF、Ang1/Tie2通路對心肌梗死大鼠血管新生的病理影響

張瓅方， 李夢華， 劉 暖， 楊 雷， 毛秉豫*

(1.南陽理工學院河南省張仲景方藥與免疫調節重點實驗室,南陽 473004；2.南陽醫學高等專科學校,南陽 473061)

心肌梗死(myocardial infarction,MI)以心肌缺血、缺氧為主要特征,其發病率和致死率均較高。據世界衛生組織統計,缺血性心臟病占到死亡總數的13%,其中MI死亡率又居首位[1]。在中國因MI致死的心臟病已排在成人死亡率的第1位,因此深入研究MI防治具有積極的現實意義。目前臨床治療MI采用的方法有口服藥物控制、外科手術以及近些年出現的介入治療,但不論是藥物還是外科干預都存有副作用或并發癥等弊端。治療性血管新生在心肌血管的再生作用被研究者稱為“分子搭橋”,鑒于MI發病機制以循環障礙為主,因此有效建立側支循環通路改善心肌供血已成為防治MI的熱門方向[2—4]。

血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是目前公認最強大的促血管生成因子,由VEGF介導的信號級聯反應在血管生成過程中發揮著重要作用。血管生成素(Ang)是目前已知所有血管生成因子中獨具核糖核酸酶活性的因子,貫穿于血管生成全部過程,促血管生成能力非常強。血管穩定因子Ang1是受體酪氨酸激酶Tie2主要激動劑,Ang1/Tie2信號通路具有維持血管完整性和促進血管新生的作用[5]。有研究顯示,小鼠體內缺失Ang1或Tie2基因,在胚胎期的血管系統發育就出現異常,小鼠壽命縮短。如Ang1不能有效激活Tie2,則血管內皮細胞和間質細胞無法緊密連接[6]。由此可見Ang1/Tie2信號通路在一定程度上彌補了VEGF的不足,尤其在促進早期小血管發育進程中發揮著比VEGF更加完善的作用。前期經過實驗研究證實了以“益氣化瘀,通絡生脈”的黃芪、丹參配伍提取物在促進MI大鼠心肌組織血管新生的作用與上調VEGF表達相關[7-8]。在此基礎上進一步觀察MI大鼠心肌組織中VEGF和Ang1/Tie2信號通路的病理變化,為中藥黃芪、丹參在促進血管新生治療MI提供實驗數據支持。

1 材料

1.1 動物

8周齡清潔級雄性SD大鼠,體重200～230 g,購自河南省實驗動物中心(動物生產許可證:SCXK(豫)2015-0005；動物質量合格證:1001297)。標準化飼養方式,動物實驗操作已通過南陽理工學院動物倫理委員會批準(批準號:2018DW-021)。

1.2 藥物、試劑、儀器

黃芪、丹參提取物在國家自然科學基金項目“黃芪丹參配伍提取物對心肌梗死后心室重構中PKD-AP-1/C-Jun-MMPs信號傳導通路影響的研究(71173372)”基礎上,由南陽理工學院方藥研究所經水提、大孔吸附樹脂純化所得(黃芪總苷含量66.9%,丹參總酚酸含量63.7%)。VEGF單克隆抗體(上海滬鼎生物科技有限公司,批號:F324458)、Ang1抗體(上海譽博生物科技有限公司,批號:K72452)、Tie2抗體(上海藍木化工有限公司,批號:S157701)、羊抗兔IgG(武漢博士德生物工程有限公司,批號:TC1378)、DAB顯色液(武漢博士德生物工程有限公司,批號:DD1660)、其他試劑為國產分析純。HX-100E型動物呼吸機(泰盟科技有限公司)、Tis型光學顯微鏡及NIS-Elements Software BR分析系統(日本尼康公司)。

2 方法

2.1 MI模型建立

參照MI大鼠模型復制過程[8],SD大鼠以10%水合氯醛3 mL·kg-1行腹部注射麻醉后,仰臥位固定手術臺上接入呼吸機和心電監護,觀察心肌梗死后心率和心電圖變化。在大鼠左側第4肋間縱切5 mm,鈍性分離肌層置開胸器,剪開心包層暴露心臟。在大鼠心臟冠狀動脈根部約3 mm處用眼科5-0型縫合線穿線結扎。肉眼可見附近心肌顏色變暗,心電圖II導連ST段弓背太高、QRS波增寬顯示模型復制成功。逐層縫合胸腔待大鼠恢復自主呼吸后撤去呼吸機和心電監護,術后行腹腔注射青霉素80萬U 3 d預防感染。正常、MI大鼠心電圖見圖1、圖2。

心率:385次/min；電壓最大值:0.25 mV；電壓最小值:-0.35 mV；電壓峰峰值0.6 mV圖1 正常大鼠心電圖Fig.1 Electrocardiogram of normal rats

心率:378次/min；電壓最大值:0.32 mV；電壓最小值:-0.1 mV；電壓峰峰值:0.43 mV圖2 MI大鼠心電圖Fig.2 Electrocardiogram of MI rats

2.2 分組、用藥

實驗分為:假手術對照組(A組,開胸穿線后不接扎)、模型組(B組,給予等量生理鹽水)、黃芪、丹參配伍提取物低、中、高劑量組(C組、D組、E組分別給予10、20、40 mg·kg-1·d-1。持續用藥4周。

2.3 大鼠一般情況

實驗過程中觀察各組大鼠的精神狀態、體重變化、身體情況、死亡情況等。

2.4 HE染色

采集大鼠心尖部組織后以10%甲醛固定24 h。裝入包埋盒中脫水并依次石蠟包埋。包埋好的組織塊以4 μm厚度切片,45 ℃烤片后標記備用,分別用于HE染色和免疫組化檢測。

HE染色步驟:先將石蠟片60 ℃加熱30 min,浸泡二甲苯內脫蠟5 min反復3次,依酒精濃度梯度遞減100%、95%、85%、75%依次脫水。用蘇木素染色5 min后水洗,鹽酸酒精分化30 s后水洗,氨水返藍30 s后水洗,轉伊紅染色10 min水洗。再次將切片依酒精濃度梯度遞增75%、85%、95%、100%依次脫水后晾干,采用中性樹膠封片。400倍光學顯微鏡拍照。

2.5 免疫組織化學染色

心肌取材部分同HE染色步驟烤片和脫蠟。抗原熱修復把切片放入枸櫞酸緩沖液(pH=6.0)95 ℃計時5 min后取出冷卻至室溫。磷酸鹽緩沖液(PBS，pH=7.2)反復清洗3次,每次5 min。滴加3%過氧化氫室溫撫育30 min后,PBS緩沖液再次重復清洗3次(5 min/次),甩干后加入5% 牛血清白蛋白(BSA)封閉30 min。去除BSA溶液后,加入一抗(1∶100稀釋的VEGF、Ang1、Tie2)覆蓋組織,置于4 ℃冷藏12 h。取出保溫盒復至常溫后清洗3次(5 min/次),加入二抗羊抗兔IgG(1∶200稀釋)37 ℃孵育60 min,二氨基聯苯胺(DAB)溶液顯色。蘇木素復染后蒸餾水洗滌,二甲苯脫水透明,采用中性樹膠封片。400倍光學顯微鏡下,取6個不重疊視野拍照分析,NIS-Elements Software BR分析系統計算VEGF、Ang1和Tie2蛋白的平均吸光度,對目標蛋白表達進行半定量分析。

2.6 統計方法

采用SPSS軟件統計分析,計量數據以均數±標準差(x±s)表示,組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 一般情況

在4周的實驗過程中,A組大鼠飲食和體重均有所增加、二便正常、精神狀態穩定、反應靈敏、皮毛有光澤度；B組大鼠飲食減少、體重下降、活動減少、反應遲緩；C組、D組和E組大鼠整體情況與B組比較有不同程度改善。40只大鼠除B組死亡1只外,其余各組均存活,大鼠資料收集完整。

3.2 HE染色結果

HE染色結果如圖3所示。A組心肌細胞完整、色澤鮮紅,各組織排列有序,細胞邊緣規則,周圍血管腔完整,顯微鏡視野下整體形態分布較完整。B組心肌組織排列紊亂,出現大片壞死并伴有周圍炎性反應,細胞邊緣伴有中性粒細胞浸潤,成纖維組織機化,整體形態模糊不清。C組、D組和E組心肌細胞色澤逐漸鮮亮轉紅,組織間隙規則,其中C組還伴有部分炎性反應和增生的成纖維組織,D組和E組的心肌細胞排列結構清晰,周圍血管腔完整。提示黃芪、丹參配伍提取物有維持細胞完整、促進血管新生的作用。

圖3 MI大鼠各組心肌組織HE染色結果(×400)Fig.3 Results of HE staining of myocardial tissue in each group of MI rats(×400)

3.3 MI大鼠各組心肌組織中VEGF、Ang1、Tie2蛋白表達影響

MI大鼠各組心肌組織切片經免疫組織化學染色后,VEGF、Ang1、Tie2陽性細胞在心肌細胞胞漿內可見深淺不一的棕褐色顆粒。經NIS-Elements Software BR分析系統顯示:與A組相比,B組胞漿中VEGF、Ang1和Tie2陽性細胞表達升高,兩組相比具有統計學差異(P<0.05)。與B組相比,C組、D組和E組胞漿中VEGF、Ang1和Tie2陽性細胞表達隨藥物濃度增高逐漸上升(P<0.05或P<0.01)。提示黃芪、丹參配伍提取物可提高VEGF、Ang1和Tie2蛋白的表達水平。見表1、圖4。

圖4 MI大鼠各組心肌組織中VEGF、Ang1、Tie2蛋白表達結果(×200)Fig.4 Results of VEGF, Ang1, Tie2 proteinexpression in myocardialtissue of MI rats (×200)

4 討論

“痹”,乃閉塞不通之義,早在《黃帝內經·素問·痹論》篇中就記載“心痹者,脈不通……痹在與脈,則血凝而不流[9]。”中國醫學中以胸部悶痛或胸痛徹背為主癥的癥候群歸為胸痹范疇診治,現代醫學中以心肌缺血、缺氧為主要特征的心肌梗死亦可納入治療。引起胸痹的原因有寒凝、氣滯、血瘀、痰濁、陽虛、氣虛等多種,總結病機不外乎虛、實兩種；治療方法有通陽散寒、行氣散結、活血化瘀等多樣,始終圍繞“不通則痛、通則不痛”的“通”法。中藥黃芪性溫味甘,有補氣升陽、托毒生肌等功效,早在《神農本草經》就記載此藥:“可治一切氣衰血虛之證”,是臨床常用補氣藥。“一味丹參飲,功同四物湯”中的丹參性微寒味苦,有活血化瘀,行氣止痛等功效,是臨床常用活血化瘀藥。黃芪、丹參合用體現中醫在胸痹病中“氣行血生”的治療特色,項目組前期觀察黃芪、丹參配伍治療能有效緩解心絞痛、心肌梗死等氣滯血瘀型患者疼痛感,改善心肌供血,臨床療效較好[10-11]。心肌梗死后的修復及預后與心肌細胞、血管功能密切相關,因此有效建立側支循環通路對改善心肌梗死區有著至關重要的意義。這種誘導心肌自我搭橋的“治療性血管新生”方法已成為現代治療心腦血管疾病的攻克方向,促進血液循環,增加血管新生的現代醫學理論恰巧與中醫學中“氣為血之帥、血為氣之母”氣行則血生的氣血并治理論相同,因此項目組繼續以從益氣化瘀、通絡生脈的黃芪、丹參配伍提取物為組合藥對,探討其促血管新生的作用機制。

表1 MI大鼠各組心肌組織中VEGF、Ang1、Tie2蛋白表達比較

注：與假手術對照組相比,*P<0.05；與模型組相比,#P<0.05、##P<0.01。

血管新生是一個復雜的系列過程,在發生過程中需要募集各種細胞因子參與。VEGF在血管新生過程中可以促進內皮細胞增值、分化,對抗炎性細胞等各種損傷因子[12]。Ang1/Tie2信號通路是近些年發現除VEGF/VEGFR信號通路之外新的血管生成通路,在血管生成的生理和病理過程中均發揮重要作用[13,14]。Ang1可維持新生血管內皮細胞穩定,限制異常血管的新生；Ang2對Ang1有拮抗作用,對內皮細胞中絲分裂信號敏感性強,促使異常血管形成。Ang1和Ang2共同作用與受體Tie2發揮調節內皮細胞穩定性的作用。血管新生的早期階段因細胞外基質發生降解伴隨著血管通透性增加,刺激一系列血管生成因子從而激發內皮細胞數量增殖遷移,是生出肉芽組織方式逐漸形成新生血管[15]。實驗結果顯示,模型組在HE染色和免疫組織化學染色中均呈現出心肌纖維化結構、組織排列紊亂,內皮細胞損傷嚴重并伴有胞核溶解現象。

在這些受損的不利因素刺激下,模型組VEGF、Ang1和Tie2蛋白因子雖有所增加,但卻未形成成熟的新生血管,并容易出現瘢痕組織,可見這是機體自我防御保護中采取的一種應急性措施。經過黃芪、丹參配伍提取物干預后,各組隨著藥物濃度的提高,原有受損的心肌組織逐漸被出現的新生血管代替,炎性侵潤減少,肉芽組織良性生成較多,心肌細胞色澤鮮紅且排列有序。VEGF、Ang1和Tie2蛋白因子呈藥物濃度依賴性增加,HE染色光學顯微鏡下心肌組織的病理形態學變化和免疫組織化學結果高度一致。

5 結論

實驗證實心肌細胞在缺血、缺氧條件下,經黃芪、丹參配伍提取物干預后作用明顯,VEGF保護性表達增加,有效地減少了內皮細胞損傷,增加血管壁通透性,促進參與血管生成因子的增殖和分化。Ang1/Tie2信號通路加速內皮細胞分化、增殖和遷移,出芽生成新的血管腔結構并維持血管腔結構穩定。VEGF和Ang1/Tie2信號通路在血管新生過程中相互協同,有效改善心肌再灌注狀態。