Cyclin D1 啟動子在養(yǎng)精膠囊促進小鼠精原干細胞增殖中的作用※

●蔡 濱 金保方 孫大林 鄧偉民

精原干細胞（spermatogonia stem cells，SSCs）是精子發(fā)生的物質(zhì)基礎，它的增殖和分化涉及多條通路、多個基因的精密調(diào)控[1]。細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）由位于人染色體11q13的CCND 1基因編碼，是調(diào)控SSCs 的重要蛋白，它能夠參與細胞周期的精確調(diào)控，維持SSCs自身數(shù)目的相對恒定，為精子發(fā)生提供源源不斷的原料[2]。Cyclin D1作為細胞周期的啟動因子，作用于G1 期，促進G1/S 期的過渡，提高S 期細胞的比例，進而促進SSCs 的增殖[3]。許多生長因子如膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（Glial cell line-derived neu?rotrophic factor，GDNF）可以作用于SSCs 表面相應受體，將信號傳遞到細胞內(nèi)，進而上調(diào)細胞核內(nèi)Cyclin D1的表達，促進SSCs的增殖[4]。

養(yǎng)精膠囊（Yangjiing Capsule，YC）是筆者團隊在臨床上常用的男科方劑，用于治療由少弱精癥導致的男性不育，療效確切。前期研究發(fā)現(xiàn)，養(yǎng)精膠囊作用于小鼠SSCs 48 h后，細胞周期中S期細胞比例明顯增加，說明養(yǎng)精膠囊能夠促進小鼠SSCs 由G1 期向S 期的過渡，進而促進細胞增殖[5]。鑒于Cyclin D1在SSCs增殖中的重要作用，筆者猜測養(yǎng)精膠囊可能通過Cy?clin D1發(fā)揮作用。因此，本研究的目的是研究養(yǎng)精膠囊是否通過Cyclin D1促進SSCs的增殖。

1 材料和方法

1.1 細胞分離及培養(yǎng)取4～6 d雄性BALB/c小鼠的睪丸，運用改良的兩步消化法+差速貼壁分選獲得高度純化的SSCs，種植到小鼠胚胎成纖維細胞飼養(yǎng)層上，每2 d更換培養(yǎng)液1次。具體步驟見參考文獻[6]。

1.2 主要試劑與藥品CCK-8 試劑盒、細胞周期試劑盒、免疫熒光檢測相關試劑（碧云天，中國）；細胞總RNA提取試劑（Trizol法）、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、定量BCR檢測試劑盒（諾唯贊，中國）；重組小鼠GDNF（Bepro Tech，美國）；兔抗鼠Cyclin D1 抗體（ab16663，Abcam，美國）；山羊抗兔二抗（ab150077，Abcam，美國）；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（promega，美國）；養(yǎng)精膠囊由中國人民解放軍東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院制劑科生產(chǎn)提供[院臨（2004）第01002 號]。養(yǎng)精膠囊水提物提取方法見參考文獻[7]。

1.3 細胞增殖檢測在96孔板中以4×103/孔的密度接種細胞懸液，放在培養(yǎng)箱中預培養(yǎng)24 h，將其隨機標記為空白對照組(Control Group)、養(yǎng)精膠囊低劑量組（YC extract 0.01 mg/mL Group）、養(yǎng)精膠囊中劑量組（YC extract 0.1 mg/mL Group）、養(yǎng)精膠囊高劑量組（YC extract 1 mg/mL Group）、陽性對照組(GDNF Group)。空白對照組未作處理，養(yǎng)精膠囊低、中、高劑量組分別加入0.01、0.1、1 mg/mL 的養(yǎng)精膠囊，陽性對照組加入20 ng/mL 的GDNF。48 h 后，向每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液，然后將培養(yǎng)板置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育2 h，用酶標儀測定在450 nm 處的吸光度。細胞增殖率=[(實驗孔吸光度-空白孔吸光度)/(對照孔吸光度-空白孔吸光度)]×100%。至少進行三次獨立重復實驗。

1.4 細胞周期檢測按“1.3”進行分組并加入相應的藥物，之后將細胞在冰浴預冷的70%乙醇中重懸，4 ℃固定過夜。1000 g左右離心3 min沉淀細胞，之后加入冰浴預冷的BBS重懸細胞，每管細胞樣品中加入0.5 mL 碘化丙啶染色復合液，37 ℃避光溫浴30 min。然后使用FACScan流式細胞儀對樣本進行分析，采用ModFit LT 3.0軟件評價G0/G1期、S期、G2/M期細胞百分比。至少進行三次獨立重復實驗。

1.5 熒光素酶報告基因?qū)嶒炘?4孔板中以5×104/孔的密度接種細胞懸液，細胞培養(yǎng)過夜后，轉(zhuǎn)染體系:每個轉(zhuǎn)染3個孔，每孔加入1 μL Lipo 3000+1 μg pRLTK 質(zhì)粒+1 μg pGL3-Cyclin D1 promoter-luci 質(zhì)粒（或者pGL3 空載質(zhì)粒）。對其進行分組，陰性對照組(YC extract+pGL3-ctrl Group)為轉(zhuǎn)染pGL3 空載質(zhì)粒24 h后再加入1 mg/mL養(yǎng)精膠囊，養(yǎng)精膠囊組（YC extract+pGL3-Cyclin D1 Group）和陽性對照組(GDNF+pGL3-Cyclin D1 Group) 分別為轉(zhuǎn)染pGL3-Cyclin D1 promoter-luci 質(zhì)粒24 h后再加入1 mg/mL 的養(yǎng)精膠囊和20 ng/mL 的GDNF，輕輕混勻，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。48 h 后，用BBS 輕輕洗2 遍，每個孔中加入100 μL 細胞裂解液，放在冰上裂解5 min，將裂解的細胞分別轉(zhuǎn)移至EB 管中，12000 rpm 離心2 min，分別取40 μL 上清轉(zhuǎn)移至96 孔板中，將LARII、stop&glo 試劑配制好，和96孔板一起放入GloMax 96微孔板發(fā)光檢測儀中，檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性。pGL3-Cyclin D1 promoter-luci質(zhì)粒委托上海捷瑞生物設計并合成。至少進行三次獨立重復實驗。

1.6 實時熒光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）實驗將接種了細胞懸液的孔板隨機分為空白對照組(Control Group)、養(yǎng)精膠囊組（YC extract Group）、陽性對照組(GDNF Group)。空白對照組未作處理，養(yǎng)精膠囊組加入1 mg/mL 的養(yǎng)精膠囊，陽性對照組加入20 ng/mL 的GDNF，作用48 h 之后將細胞用Trizol 試劑提取總RNA，之后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，以cDNA 為模版進行擴增，所用引物由上海捷瑞生物設計并合成。BCR 擴增引物序列如下:Cyclin D1 上游引物為5’-GATGAAGGAGACCATTCCCTTG-3’，下游引物為5’-TCACCAGAAGCAGTTCCATTT-3’；GABDH 上游引物為5’-GGGTGTGAACCACGAGAAATA-3’，下游引物為5’-GTCATGAGCCCTTCCACAAT-3’。

加樣體系按照定量BCR 檢測試劑盒說明進行操作，反應采用標準的兩步法:95 ℃、1 min，1 個循環(huán)；95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，40 個循環(huán)，采用溶解曲線判斷擴增產(chǎn)物是否單一，采用2—△△Ct法計算表達量的相對比值。至少進行三次獨立重復實驗。

1.7 細胞免疫熒光（immunofluorescence，IF）實驗將2 cm×2 cm 載玻片滅菌后置于6 孔板中，細胞用0.25%胰蛋白酶消化后，接種于6 孔板中，培養(yǎng)24 h，按“1.6”對其進行分組，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h 后，加入4%多聚甲醛固定10～15 min，加入0.2%Trinton X-100透化15 min，每張玻片加入羊血清150 μL，封閉30 min后，加入兔抗鼠Cyclin D1抗體（1:200），4 ℃過夜，加入山羊抗兔二抗（1:1000），37 ℃孵育1 h，加入1 μg/mL DABI染色15 min，BBS沖洗后，甘油封片，于熒光顯微鏡下觀察并照相。至少進行三次獨立重復實驗。

1.8 細胞阻斷實驗委托上海捷瑞生物針對Cyclin D1基因設計干擾RNA（siRNA）序列，同時設計一條陰性對照（siRNA-NC）序列，通過BLAST 驗證該序列對于其他基因無干擾效果。siRNA-Cyclin D1 引物序列為CAGGATGATGAAGTGAACACACTCA；siRNA-NC引物序列為GTACCAACAAGACAGTGCTAGTAGA。

轉(zhuǎn)染siRNA-Cyclin D1 之前先將SSCs 以1×105/孔接種至六孔板中，待細胞長至60%密度時采用Lipo 3000 將siRNA-Cyclin D1/siRNA-NC 轉(zhuǎn)染進細胞，37 ℃孵育24 h后加入1 mg/mL的養(yǎng)精膠囊提取液，根據(jù)所轉(zhuǎn)染的基因序列相應地分為養(yǎng)精膠囊+siRNACyclin D1組（YC extract+siRNA-Cyclin D1 Group）與養(yǎng)精膠囊+siRNA-NC 組（YC extract+siRNA-NC Group），繼續(xù)培養(yǎng)48 h 進行后續(xù)檢測。至少進行三次獨立重復實驗。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法所有數(shù)據(jù)都采用SBSS 20.0 統(tǒng)計軟件分析。各組計量資料采用均數(shù)±標準差(±s)表示。符合正態(tài)分布的兩組定量數(shù)據(jù)的比較，采用two-tailed Student’s t-test分析；非正態(tài)分布的兩組定量數(shù)據(jù)的比較，采用Mann-Whitney U檢驗。P<0.05認為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 養(yǎng)精膠囊對SSCs 增殖活性、細胞周期的影響圖1A表明，在SSCs培養(yǎng)液中分別加入0.01、0.1、1 mg/mL濃度的養(yǎng)精膠囊48 h后，與空白對照組相比，細胞的增殖活性分別提高了19.8%、68.4%、78.0%，有統(tǒng)計學差異（P<0.05，P<0.01），表明低、中、高劑量的養(yǎng)精膠囊均能促進SSCs 的增殖；陽性對照組與空白對照組相比，細胞的增殖活性提高了118.0%，有統(tǒng)計學差異（P<0.01）。圖1B 表明，0.1、1 mg/mL 濃度的養(yǎng)精膠囊作用48 h 后，S 期細胞的比例比空白對照組分別提高了8.2%、26.4%，有統(tǒng)計學差異（P<0.05，P<0.01），表明中、高劑量的養(yǎng)精膠囊均能提高S 期細胞的比例；陽性對照組與空白對照組相比，S 期細胞的比例提高了36.7%，有統(tǒng)計學差異（P<0.01）。

圖1 養(yǎng)精膠囊對SSCs增殖活性、細胞周期的影響

2.2 養(yǎng)精膠囊對Cyclin D1 啟動子、mRNA 和蛋白水平的影響圖2A表明，高劑量（1 mg/mL）的養(yǎng)精膠囊和GDNF作用48 h后，Cyclin D1啟動子的活性比陰性對照組分別增強103.7%、121.3%，有統(tǒng)計學差異（P<0.01），說明高劑量的養(yǎng)精膠囊和GDNF 均能增強Cyclin D1 啟動子的活性。圖2B 表明，高劑量的養(yǎng)精膠囊和GDNF 作用48 h后，Cyclin D1 mRNA 的表達比空白對照組分別提高85.5%、106.4%，有統(tǒng)計學差異（P<0.01），說明高劑量的養(yǎng)精膠囊和GDNF 均能提高Cyclin D1 mRNA 的表達。圖2C 表明，高劑量的養(yǎng)精膠囊和GDNF 作用48 h 后，Cyclin D1 的蛋白表達提高，并且主要集中在細胞核內(nèi)。

圖2 養(yǎng)精膠囊對Cyclin D1 啟動子、mRNA和蛋白水平的影響

2.3 阻斷Cyclin D1后養(yǎng)精膠囊對SSCs的影響圖3A 表明，加入siRNA-Cyclin D1 預處理后再加入高劑量的養(yǎng)精膠囊培養(yǎng)48 h，細胞的增殖活性比養(yǎng)精膠囊+siRNA-NC 組降低23.9%，有統(tǒng)計學差異（P<0.01），表明阻斷Cyclin D1 能夠抑制SSCs 的增殖。圖3B 表明，養(yǎng)精膠囊+siRNA-Cyclin D1 組與養(yǎng)精膠囊+siRNA-NC 組相比，S 期細胞比例減少12.9%，有統(tǒng)計學差異（P<0.01），表明阻斷Cyclin D1能夠降低S期細胞比例。

圖3 阻斷Cyclin D1后養(yǎng)精膠囊對SSCs的影響

2.4 阻斷Cyclin D1 后養(yǎng)精膠囊對Cyclin D1 的影響圖4A 表明，加入siRNA-Cyclin D1 預處理后再加高劑量的養(yǎng)精膠囊培養(yǎng)48 h，Cyclin D1啟動子的活性與養(yǎng)精膠囊+siRNA-NC 組相比降低18.6%，有統(tǒng)計學差異（P<0.01）。圖4B 表明，養(yǎng)精膠囊+siRNA-Cyclin D1 組與養(yǎng)精膠囊+siRNA-NC 組相比，Cyclin D1 mRNA 的表達降低15.6%，有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。圖4C 表明，養(yǎng)精膠囊+siRNA-Cyclin D1 組與養(yǎng)精膠囊+siRNA-NC組相比，Cyclin D1的蛋白表達降低。

3 討論

養(yǎng)精膠囊是東南大學附屬中大醫(yī)院金保方教授運用中醫(yī)學“腎藏精”的理論，以補腎填精、益氣活血為法創(chuàng)立的經(jīng)驗方，由淫羊藿、熟地、黃精、紫河車、沙苑子、煅牡蠣、黃芪、當歸、荔枝核、王不留行、炙水蛭共11 味中藥組成。方中淫羊藿味辛、甘，性溫，走肝腎二經(jīng)，為補命門、益精氣之要藥；熟地味甘，性微溫，亦歸肝腎二經(jīng)，有補血養(yǎng)陰、填精益髓之功，九蒸九曬熟地為補血之首劑，與淫羊藿相伍，陰陽互根互用，增強療效；紫河車乃血肉有情之品，扶正固本，養(yǎng)血益精；黃芪-黃精為補氣養(yǎng)陰固精的常用藥對，氣陰雙補，使得陽有所依；沙苑子、煅牡蠣其性下行，補腎固精，煅牡蠣還含有精子生長所必須的鋅、硒等微量元素；荔枝核、當歸、炙水蛭、王不留行共奏行氣活血之功，使得藥物補而不滯，滋而不膩。方中除了傳統(tǒng)補腎填精之藥，還添加了行氣活血之藥，既能補腎入精室，又能行氣活血以養(yǎng)精生精。這種補腎填精與行氣活血藥物的配合，可改善睪丸和附屬性腺的內(nèi)環(huán)境，促進精子發(fā)生，提高臨床療效[8-11]。

Cyclin D是1991年由Motokura等[12]在研究甲狀旁腺癌時首先分離，主要包括Cyclin D1、D2、D3 三個亞型，三者在氨基酸序列上有高度同源性。Ciraolo 等[4]研究發(fā)現(xiàn)，GDNF 通過激活BI3K中的p110α亞基引起下游Akt 的磷酸化，進而上調(diào)Cyclin D1 的表達，促進SSCs 的自我更新與增殖。本研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)精膠囊可以促進SSCs的增殖、提高S期細胞的比例（圖1），并且增強Cyclin D1 啟動子的活性，促進Cyclin D1 mRNA 和蛋白的表達（圖2）。為了研究養(yǎng)精膠囊是否通過Cy?clin D1 產(chǎn)生作用，本研究運用siRNA-Cyclin D1 阻斷Cyclin D1的表達，發(fā)現(xiàn)阻斷Cyclin D1之后，SSCs的增殖活性降低、S 期細胞比例減少（圖3），同時伴隨著Cyclin D1啟動子的活性降低，mRNA和蛋白的表達減少（圖4）。

圖4 阻斷Cyclin D1后養(yǎng)精膠囊對Cyclin D1的影響

綜上，養(yǎng)精膠囊可以通過增強Cyclin D1啟動子的活性提高Cyclin D1 的轉(zhuǎn)錄和翻譯水平，進而促進SS?Cs 增殖。這對于闡明補腎填精法改善男性生殖功能的作用靶點，揭示“腎藏精”的科學內(nèi)涵，進而指導臨床運用中藥治療少弱精癥，具有重要的理論意義和臨床價值。當然，基因的轉(zhuǎn)錄涉及啟動子、轉(zhuǎn)錄因子、RNA 聚合酶等的協(xié)同作用，養(yǎng)精膠囊如何增強Cyclin D1啟動子的活性的分子機制有待進一步探索。