七彩神仙魚腦組織轉錄組mRNAs差異表達分析

劉怡南　溫彬　陳再忠

摘要：【目的】挖掘七彩神仙魚（Symphysodon haraldi）腦組織性別差異基因，為揭示腦組織性別相關基因調控繁殖生理機制打下基礎。【方法】利用Illumina HiSeq 6000測序平臺對七彩神仙魚雌、雄腦組織樣本進行轉錄組測序分析，經過濾和Trinity組裝獲得基因，采用DIAMOND進行功能注釋;并選取NR、GO、KEGG、Pfam、Swiss-Prot和eggNOG等數據庫進行比對，篩選出差異表達候選基因;隨機選取6個差異表達基因進行實時熒光定量PCR驗證。【結果】從構建的七彩神仙魚腦組織cDNA文庫測序獲得337190200條原始數據（Raw reads），經質量篩選后獲得34109個基因（平均長度1007.00 bp）和67488個轉錄本（平均長度694.00 bp）。經生物信息學分析方法篩選，最終獲得85個差異表達基因（61個在雄魚腦組織中高表達，24個在雌魚腦組織中高表達），包括黑色素濃集激素（MCH）、催乳素釋放激素（Prlh）、垂體同源結構域轉錄因子2（pitx2）、免疫球蛋白家族成員（DSCAM和IGDCC3）、溶質載體（UNC93B1）及醛糖還原酶（AKR1B1）等功能基因。與雌魚腦組織相比，雄魚腦組織中涉及細胞突觸傳遞、激素調控、信號傳導、黑色素濃集激素、催乳素釋放激素、生長激素和G蛋白偶聯受體的基因呈下調趨勢，而涉及離子運輸和免疫反應的基因呈上調趨勢。隨機選取6個差異表達基因（Prlh、pitx2、MCH、LMX1A、KBP和CRP）進行實時熒光定量PCR驗證，結果顯示，Prlh、pitx2、MCH、LMX1A和KBP基因在雌魚腦組織的相對表達量較高，而CRP基因在雄魚腦組織的相對表達量較高。【結論】MCH、Prlh、pitx2、DSCAM、IGDCC3、UNC93B1、AKR1B1和Nid1等基因在七彩神仙魚腦組織中呈性別差異表達，可能在調節腦組織類固醇激素形成及配子發生的過程中發揮重要作用，可作為候選基因應用于七彩神仙魚腦組織性別相關基因調控繁殖生理機制研究。

關鍵詞： 七彩神仙魚;轉錄組;腦組織;性別差異基因

中圖分類號： S965.82 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）11-2827-09

Differential expression analysis of mRNAs based on brain transcriptome in the discus fish（Symphysodon haraldi）

LIU Yi-nan1，2，3， WEN Bin1，2，3， CHEN Zai-zhong1，2，3*

（1National Demonstration Center for Experimental Fisheries Science Education（Shanghai Ocean University）， Shanghai ?201306， China; 2Shanghai Engineering Research Center of Aquaculture（Shanghai Ocean University）， Shanghai ?201306， China; 3Key Laboratory of Freshwater Aquatic Genetic Resources， Ministry of Agriculture and

Rural Affairs（Shanghai Ocean University）， Shanghai ?201306， China）

Abstract：【Objective】Exploring the sex-biased genes in brain tissue of discus fish（Symphysodon haraldi） could lay the foundation for revealing the physiological mechanism of sex-related genes in discus brain that regulated reproduction.【Method】The Illumina HiSeq 6000 sequencing platform was used to perform transcriptome sequencing analysis on the brain tissue of female and male discus fish.The genes were obtained after filtration and assembled by Trinity， and DIAMOND was used for functional annotation. The NR， GO， KEGG， Pfam， Swiss-Prot， and eggNOG database were selec-ted for comparison and filtered out the differential candidate genes.Randomly selected six differentially expressed genes for qRT-PCR validation. 【Result】From the constructed discusbrain cDNA library， 337190200 raw reads were sequenced. After quality screening， 34109 genes（average length 1007.00 bp） and 67488 transcripts（average length 694.00 bp） were obtained. Screened by bioinformatics analysis，obtained total of 85 differentially expressed genes（61 were highly expressed in male fish brain， 24 were highly expressed in female fish brain） were obtained， including melanin-concentrating hormone（MCH）， prolactin release Hormone（Prlh）， pituitary homeodomain transcription factor 2（pitx2）， immunoglobulin family members（DSCAM and IGDCC3）， solute carrier（UNC93B1） and aldose reductase（AKR1B1）. Compared with female fish， among these genesinmale fish brain tissues，which involved in cell synaptic transmission， hormone regulation， signal transduction， melanin-concentrating hormone， prolactin releasing hormone， growth hormone and G protein-coupled receptors were down-regulated; which involved in ion transport and immune response were up-regulated. Randomly selected six differentially expressed genes（Prlh， pitx2， MCH， LMX1A， KBP and CRP） for validated by qRT-PCR. The results showed that the relative expression levels of Prlh， pitx2， MCH， LMX1A and KBP in female fish brain were high， and the relative expression of CRP in male brain tissue was high. 【Conclusion】Genes such as MCH， Prlh， pitx2， DSCAM， IGDCC3， UNC93B1， AKR1B1 and Nid1 were differentially expressed in the brain tissue of discusfish， which might play an important role in regulating the formation of steroid hormones and gametogenesis， and can be used as candidate genes in the research of discus fish brain tissue sex-biased gene regulating reproduction physiological mechanism.

Key words： discus fish; transcriptome; brain tissue; sex-biased gene

Foundation items： Shanghai Natural Science Foundation（20ZR1423600）; Shanghai Sailing Program（19YF1419400）

0 引言

【研究意義】七彩神仙魚（Symphysodon haraldi）原產于南美洲亞馬遜流域，因其鮮艷的色彩及優雅的游姿，被譽為熱帶觀賞魚之王，在淡水觀賞魚貿易中占據重要地位（劉曉東和陳再忠，2008;李浩然等，2015）。七彩神仙魚對水環境要求苛刻，雌、雄魚完全性成熟需要12個月，成年雄性個體較成年雌性個體大，因此更具觀賞價值。目前，七彩神仙魚的繁殖仍然依靠自然配對，但配對時間和繁殖周期較長，極大限制了七彩神仙魚的規模化人工繁育（林睿涓，2017）。在脊椎動物的繁殖過程中，大腦通過下丘腦—垂體—性腺軸（BPG）調控和維持動物機體的生殖發育及其性行為（Weltzien et al.，2004）。BPG軸包含促性腺激素釋放激素（GnRH）和促性腺激素（GTH）等神經激素，而這些神經激素受大量基因調控，因此，挖掘七彩神仙魚腦組織中的性別差異基因，對探究腦組織性別相關基因在兩性繁殖生理中的作用機理具有重要意義。【前人研究進展】目前，已在動物機體腦組織中發現一些與性別差異相關的基因，其作為轉錄因子在影響性別發育的過程中發揮重要作用。SRY基因是雄性性別決定基因，在腦黑質的形成過程中發揮關鍵作用（Natàlia et al.，2009）;Cbln1基因在雄性小鼠（Mus musculus）中高表達，且在雄性小鼠性別發育過程中不可或缺（Ikeda et al.，2012）;LOC101160739基因與雄性個體的性行為有關（Pauletto et al.，2018）。在硬骨魚類中，Tcf12基因在雄性鰷魚（Pimephales promelas）個體中參與抗雌性激素反應，在其性別發育及繁殖過程中發揮重要作用（Garcia-Reyero et al.，2009）;PSCA基因在雄性黃顙魚（Pelteobagrus fulvidraco）腦組織中特異表達（Lu et al.，2015）;同樣，在雌性魚類腦組織中也存在一些與性別相關的基因，如fzd10基因參與斑馬魚（Danio rerio）的Wnt信號通路，與雌性個體的性別發育相關，而spry4基因通過抑制受體酪氨酸激酶（RPTKs）信號，對維持雌性腦組織的正常發育起關鍵作用（Santos et al.，2008）;Cyp19a1b基因則參與黑鯛（Acanthopagrus schlegeli）雌激素的合成（Wu et al.，2010）。此外，諸多配子基因對存在性別差異表達方式，如chd1z/chd1w（Agate et al.，2004）、Utx/Uty（Xu et al.，2005）和Usp9x/Usp9y（Xu et al.，2008）等，其在兩性發育過程中均發揮重要作用。【本研究切入點】本課題組前期已從七彩神仙魚性腺轉錄組中鑒定出與性別相關的基因，并分析其相關功能（徐哲，2018），但針對七彩神仙魚腦組織中與性別差異表達相關的基因尚無研究報道。【擬解決的關鍵問題】利用Illumina HiSeq 6000測序平臺對七彩神仙魚轉錄組進行測序分析，篩選出雌、雄魚腦組織差異表達基因，為揭示腦組織性別相關基因調控繁殖生理機制打下基礎。

1 材料與方法

1. 1 樣品采集

從上海海洋大學濱海養殖基地七彩神仙魚養殖車間選取12月齡性成熟七彩神仙魚雄魚3條（99.0±15.8 g/尾）、雌魚3條（90.0±13.2 g/尾）。供試驗七彩神仙魚經100 mg/L MS-222麻醉后，分別采集其腦組織立即冷凍，-80 ℃液氮保存備用。

1. 2 RNA提取與cDNA文庫構建及測序

按miRNeasy試劑盒（美國QIAGEN公司）說明提取樣本總RNA，經質檢合格后使用連接有Oligo（dT）的磁珠富集mRNAs。使用六堿基隨機引物（Random hexamers）合成cDNA第一鏈，隨后加入緩沖液、dNTPs、RNaseH和DNA Polymerase I合成cDNA第二鏈;經修復、篩選后進行PCR擴增并構建cDNA文庫。文庫質檢合格后采用Illumina HiSeq 6000進行測序分析。

1. 3 mRNAs轉錄組數據生物信息學分析

測序獲得的原始數據（Raw reads）經預處理，使用Cutadapt去除測序接頭，以fqtrim過濾掉不合格序列即得到有效數據，然后通過Trinity組裝獲得基因并進行質量評判，包括基因長度、GC含量和N50等。采用DIAMOND進行功能注釋，并選取NR、GO、KEGG、Pfam、Swiss-Prot和eggNOG等數據庫進行比對;同時對比雌、雄魚腦組織中顯著差異表達的基因[表達量差異倍數（log2絕對值）≥1，P≤0.05]，并結合其在NR、GO、KEGG、Pfam、Swiss-Prot和eggNOG等數據庫中的注釋信息，篩選出雌、雄魚腦組織間的差異表達基因。

1. 4 實時熒光定量PCR驗證

為了驗證測序篩選結果的準確性和可靠性，采用實時熒光定量PCR隨機在mRNAs轉錄組中選擇6個差異表達基因進行驗證。擴增引物（表1）采用Primer 5.0進行設計，并委托南京建成科技有限公司合成。實時熒光定量PCR擴增程序：95 ℃預變性2 min;95 ℃ 10 s;60 ℃ 20 s;進行40個循環;72 ℃延伸60 s。經SYBR通道檢測熒光信號，發現18S rRNA在七彩神仙魚雌、雄魚腦組織中無差別且穩定表達，因此將其作為本研究的管家基因。管家基因和目的基因的擴增效率相同，采用2-ΔΔCt法換算目的基因相對表達量。

2 結果與分析

2. 1 mRNAs轉錄組組裝及功能注釋結果

利用Illumina HiSeq 6000平臺對構建的七彩神仙魚腦組織cDNA文庫進行測序分析，結果在6個cDNA文庫中共獲得337190200條Raw reads;經質量篩選后獲得34109個基因（平均長度1007.00 bp）和67488個轉錄本（平均長度694.00 bp）。將34109個基因輸入NR、GO、KEGG、Pfam、Swiss-Prot和eggNOG等數據庫中進行比對，結果（表2）顯示，在NR數據庫中共比對出16220個基因（占47.55%），比對得到序列最多的是尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）（占30.04%），其次是斑馬擬麗魚（Maylandia zebra）（占9.61%）和新亮麗鯛（Neolamprologus brichardi）（占7.34%），說明七彩神仙魚轉錄組測序比對得到親緣關系最近的物種是羅非魚。在eggNOG數據庫中共比對出15242個基因（占44.69%），發現大量基因參與細胞運輸、囊泡運輸、信號轉導、蛋白質翻譯及轉錄等過程。在GO數據庫中共比對出13624個基因（占39.94%），分別包含在25個生物過程（Biological process）、15個細胞組成（Cellular component）和10個分子功能（Molecular function）中（圖1）。在生物過程中，以參與生化過程、DNA模板轉錄調節、發育過程及信號傳導過程的基因最多;在細胞組成中，以參與細胞膜及膜組成的基因最多;在分子功能中，則以參與金屬離子結合、分子功能及ATP結合過程的基因最多。

在生物體中，不同基因產物會通過有序的相互協調而行使其生物學功能。在KEGG數據庫中有12746個基因（占37.37%）被富集到3274個KEGG信號通路，可劃分為有機系統、新陳代謝、人類疾病、遺傳信息加工、環境信息處理和細胞過程等六大類（圖2）。其中，以參與細胞過程的基因最多（占18.29%），主要參與細胞運輸、分解代謝及生長調節過程;有11.86%的基因參與有機系統，包括內分泌系統、循環系統和免疫系統;有15.35%的基因參與新陳代謝，包括氨基酸代謝、脂質代謝和碳水化合物代謝;有5.60%的基因參與人類疾病，主要涉及內分泌代謝疾病和傳染疾病;有12.21%的基因參與遺傳信息加工，包括翻譯、折疊、分類和降解;有15.07%的基因參與環境信息處理，主要涉及信號傳導和信號分子相互作用。

2. 2 七彩神仙魚雌、雄魚腦組織間的差異表達基因

依據雌、雄魚腦組織表達量差異倍數（log2絕對值）≥1且P≤0.05的標準，篩選七彩神仙魚雌、雄魚腦組織間的差異表達基因，結果獲得85個差異表達基因。85個差異表達基因在6個樣品中的具體表達情況詳見圖3。與雌魚相比，有61個差異表達基因在雄魚腦組織中呈上調表達、24個差異表達基因呈下調表達。將部分差異表達基因的GO功能注釋結果與KEGG信號通路富集分析結果進行對比，結果（表3）發現：（1）涉及細胞突觸傳遞、激素調控及信號傳導的基因呈差異表達，且呈下調趨勢;（2）涉及黑色素濃集激素、催乳素釋放激素、生長激素和G蛋白偶聯受體的基因呈差異表達，也呈下調趨勢;（3）涉及離子運輸和免疫反應的基因也呈差異表達，但呈上調趨勢。

2. 3 實時熒光定量PCR驗證結果

隨機選取6個差異表達基因（Prlh、pitx2、MCH、LMX1A、KBP和CRP），采用實時熒光定量PCR檢測其在七彩神仙魚雌、雄魚腦組織中的表達情況，結果（圖4）顯示，Prlh、pitx2、MCH、LMX1A和KBP基因在雌魚腦組織中的相對表達量較高，而CRP基因在雄魚腦組織中的相對表達量較高。可見，實時熒光定量PCR驗證結果與Illumina HiSeq 6000測序結果基本一致，說明Illumina HiSeq 6000測序結果準確可靠。

3 討論

本研究對七彩神仙魚雌、雄魚腦組織轉錄組進行測序、組裝和注釋，結果獲得85個差異表達基因;與雌魚相比，有61個差異表達基因在雄魚腦組織中呈上調表達、24個差異表達基因呈下調表達。這些差異表達基因主要涉及到激素合成、細胞組成、信號傳導和免疫反應等方面。MCH是一種由下丘腦外側神經元產生的高效增強食物攝取的調節因子（Tritos and Maratos-Flier，1999），已有研究證實GnRH神經元所在區域存在MCH神經纖維，且在GnRH神經元活動的視前區高表達，對GnRH神經元有直接或間接的調節作用，而影響GnRH和促黃體素的分泌（Williamson et al.，2005）。GnRH通過調節MCH而調控魚類的攝食情況（Amiya et al.，2008），即MCH可作為能量調節與生殖調節間的另一種潛在整合信號，通過下丘腦的食欲調節因子影響神經系統的生殖功能（Smith and Grove，2002）。因此，MCH基因在七彩神仙魚雌魚腦組織中高表達可能與其生殖功能存在密切聯系。Prlh神經纖維可投射到垂體中，促使垂體前葉細胞分泌催乳素并廣泛參與神經分泌及自主神經調節（Wang et al.，2012），在下丘腦—垂體—卵巢軸中發揮重要作用（Kataoka et al.，2001），或通過大腦視前區中的GnRH神經元介導促黃體生成激素分泌（Watanobe，2001）;此外，Prlh可刺激人類垂體腺分泌生長激素。pitx2是POU1F-PROP1通路的成員之一（Davis et al.，2010），在腦和垂體等器官的發育過程中發揮重要作用（Rodríguez-León et al.，2008;Liu et al.，2013）。pitx2通過調節POU1F1、LHX3及PROP1等垂體轉錄因子，而影響催乳素、促黃體生成激素、促卵泡激素和生長激素的分泌。此外，pitx2基因在胚胎、成體體細胞及生殖細胞中均有表達，在生物體胚胎至性成熟階段發揮著性別調控作用（Nandi et al.，2011）。本研究發現MCH、Prlh和pitx2基因在七彩神仙魚雌魚腦組織中高表達，推測這些基因在調節七彩神仙魚腦組織性別相關激素的合成與釋放過程中發揮重要作用。

在七彩神仙魚雄魚腦組織中也存在一些高表達的差異表達基因，包括DSCAM、IGDCC3、UNC93B1、AKR1B1和Nid1等基因。DSCAM是細胞答黏附分子（Ig-CAM）免疫球蛋白家族的成員之一，在果蠅、小鼠及人類的神經系統中廣泛表達，具有較高的表達水平，可能在神經系統的發育及神經網絡的形成過程中發揮重要作用（Schmucker et al.，2000）。劉聰輝（2016）研究表明，DSCAM基因除了在哺乳動物的腦組織中高表達外，還在精巢中特異性表達，且參與精子的形成及精卵識別過程，但在卵巢中幾乎不表達。IGDCC3是免疫球蛋白家族的DCC類成員，在腦組織中大量表達，且在精巢中的表達量是在卵巢中的5倍（Fagerberg et al.，2014）。UNC93B1是一種Toll樣受體（TLRs）信號調節劑，在TLRs從內質網向內溶酶體的運輸過程中扮演重要角色（Lee et al.，2013）。在大腦皮質、海馬體和小腦中均發現有UNC93A基因表達，且在許多神經元包括GnRH神經元中也有表達（Ceder et al.，2017）。AKR1B1是多元醇形成途徑的成員，是一種利用煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）作為電子供體將葡萄糖還原成山梨醇的生物酶，而山梨醇是精子的能量來源（Oates，2012），因此AKR1B1與精子的運動存在密切聯系，其在精子、附睪上皮和附睪小體細胞中均有表達，且以在附睪近端和中段的表達活性最高（Frenette et al.，2003）。在小鼠的相關研究中還發現，Nid1與精巢的正常生理代謝有關，在精巢雄性激素受體及睪丸支持細胞中均有表達（Tainaka et al.，2012）。上述差異表達基因在七彩神仙魚雄魚腦組織中高表達，故推測其在七彩神仙魚雄性生殖系統中發揮重要作用。

本研究基于Illumina HiSeq高通量測序技術分析七彩神仙魚雌、雄魚腦組織性別差異基因的表達情況，并通過生物信息學分析方法進行篩選，最終獲得85個差異表達基因（61個在雄魚腦組織中高表達，24個在雌魚腦組織中高表達），其中MCH、Prlh、pitx2、DSCAM、IGDCC3、UNC93B1、AKR1B1和Nid1等基因可能在調節大腦類固醇激素形成及配子發生的過程中發揮重要作用，可作為候選基因應用于七彩神仙魚腦組織性別相關基因調控繁殖生理機制研究。

4 結論

MCH、Prlh、pitx2、DSCAM、IGDCC3、UNC-93B1、AKR1B1和Nid1等基因在七彩神仙魚雌、雄魚腦組織中呈明顯的差異表達，可能在調節大腦類固醇激素形成及配子發生的過程中發揮重要作用，可作為候選基因應用于七彩神仙魚腦組織性別相關基因調控繁殖生理機制研究。

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（責任編輯 蘭宗寶）

收稿日期：2020-02-18

基金項目：上海市自然科學基金項目（20ZR1423600）;上海市揚帆人才計劃項目（19YF1419400）

作者簡介：*為通訊作者，陳再忠（1972-），博士，教授，主要從事觀賞魚繁殖遺傳育種生物學研究工作，E-mail：chenzz@shou.edu.cn。劉怡南（1994-），研究方向為觀賞魚繁殖生物學，E-mail：liuyinan941024@163.com