Bacillus paralicheniformis左聚糖蔗糖酶基因克隆表達及酶學性質研究

叢豪　羅寧　黃飛　梁月昭　陳碩昌　張聲峰　朱萍　楊輝

摘要：【目的】從耐熱菌株中克隆表達左聚糖蔗糖酶基因，以獲得熱穩定性較好、底物耐受性高的重組酶，為左聚糖蔗糖酶催化機理及生產應用研究提供技術基礎。【方法】從市售菌肥中篩選耐熱菌株并克隆其左聚糖蔗糖酶基因，以pSE380為載體構建重組質粒并轉化至大腸桿菌誘導表達，隨后通過鎳親和層析獲得電泳純的重組左聚糖蔗糖酶并研究其酶學性質。【結果】分離到耐熱菌株LN-05，經16S rDNA序列分析鑒定為Bacillus paralicheniformis。克隆表達的B. paralicheniformis左聚糖蔗糖酶與已公布地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）RN-01的左聚糖蔗糖酶存在19個氨基酸殘基差異。重組酶催化水解反應最適pH為6.0，最適溫度為45 ℃，于40和45 ℃保溫3 h后殘余酶活力分別為89%和78%。Mn2+、Ag3+和Cr2+對重組左聚糖蔗糖酶的水解活力有明顯抑制作用，Co2+和Al3+對水解活力具有一定促進效果;Ba2+、Mg2+和Mn2+對聚合活力有明顯抑制作用，Ag3+、Cu2+和K+對聚合活力具有促進作用。EDTA對重組酶水解活力和聚合活力均具有抑制作用。在最適條件下，重組左聚糖蔗糖酶的最大反應速率（Vmax）=74 μmol/（min·mg），米氏常數（Km）為7.57 mmol/L。催化聚合反應的最適溫度隨著底物蔗糖濃度而變化，當蔗糖濃度為50%時，最適溫度為40 ℃;最適聚合反應pH為5.0;當酶濃度為0.9 U/mL，在最適條件下反應24 h，左聚糖產糖量達183.00±1.73 g/L，蔗糖轉化率為（36.76±1.84）%。【結論】B. paralicheniformis左聚糖蔗糖酶的熱穩定性較好，左聚糖產量高，具有轉化蔗糖生產高附加值左聚糖的應用潛力。

關鍵詞： Bacillus paralicheniformis;左聚糖蔗糖酶;克隆表達;酶學性質;熱穩定性

中圖分類號： S188.3 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標志碼： A 文章編號：2095-1191（2020）11-2808-09

Cloning，expression and enzymatic properties of the levansucrase gene from Bacillus paralicheniformis

CONG Hao1，2， LUO Ning1， HUANG Fei1， LIANG Yue-zhao1， CHEN Shuo-chang1，

ZHANG Sheng-feng1， ZHU Ping1， YANG Hui1，2，3*

（1College of Life Sciences and Technology， Guangxi University， Nanning ?530004， China; 2Guangxi Research Center for Microbial and Enzyme Engineering Technology， Nanning ?530004， China; 3State Key Laboratory for

Conservation and Utilization of Subtropical Agro-bioresources， Nanning ?530004， China）

Abstract：【Objective】Cloning and expressing of a levansucrase gene from heat-resistant strains in order to obtain a recombinant enzyme with good thermal stability and high substrate tolerance，which would provide basis for the study on catalytic mechanism and levansucrase production. 【Method】Heat-resisting strain was screened from commercial fertilizer. Then the gene of levansucrase was cloned. With pSE380 as vector， ?recombinant plasmid was constructed and transformed into Escherichia coli induced expression. Then electrophoresis pure recombinant levosucrase was obtained by nickel affinity chromatography and its enzymatic properties were studied. 【Result】A heat-resistant strain LN-05 was isola-ted and identified as Bacillus paralicheniformis by 16S rDNA sequencing analysis. B. paralicheniformis levansucrase was then cloned and expressed， which had nineteen amino acid residues difference from the B. licheniformis RN-01 levansucrase previously reported. The enzymatic properties showed that the optimum pH of hydrolysis reaction was 6.0，the optimum temperature was 45 ℃. The residual activity were 89% and 78% of the enzyme incubated for 3 h at 40 and 45 ℃，respectively. The presence of Mn2+，Ag3+ and Cr2+ inhibited hydrolytic activities while Co2+ and Al3+showed positive effects. Ba2+，Mg2+ and Mn2+ had inhibitory effect on the polymerization activities， while Ag3+，Cu2+ and K+had positive effects. EDTA had an inhibitory effect on both recombinant enzyme hydrolysis activity and recombinant enzyme polymerization activity. Under the optimal conditions，the maximum reaction rate（Vmax） of the recombinant levansucrase was Vmax=74 μmol/（min·mg），Michaelis constant（Km）=7.57 mmol/L. The optimum temperature of polymerization reaction varied with the sucrose substrate concentration. The optimum temperature was 40 ℃ at the sucrose concentration of 50%， and its optimum polymerization pH was 5.0. Reacted with 0.9 U/mL enzyme under this optimum condition for 24 h， the amount of the produced levan reached about 183.00±1.73 g/L and the conversion yieldwas（37.76±0.80）%. 【Conclusion】The obtained B. paralicheniformis levansucrase has fine thermal stability and high levan yield， and has the potential to ?transform sucrose to high value-added levan.

Key words： Bacillus paralicheniformis; levansucrase; cloning and expression; enzymatic properties; thermal stability

Foundation item： Guangxi Natural Science Foundation（2017GXNSFAA198128）; Science Research and Techno-logy Development Project of Nanning（20141015）

0 引言

【研究意義】左聚糖是一種由果糖基組成的多糖，其純品為白色粉末，無味、能溶于水或水的混合溶劑，不溶脹、不形成凝膠，具有假塑性（Bae et al.，2008）;此外，其化學結構較穩定，有一定的溫度穩定性（Barone and Medynets，2007）。左聚糖具有廣泛的應用范圍和良好的市場前景（Li et al.，2015），在醫學領域具有抗腫瘤活性（Yoo et al.，2004），在食品行業具有益生作用（Korakli et al.，2003），且廣泛應用于其他商業非酒精飲料（Bello et al.，2001）。左聚糖蔗糖酶屬于GH68糖苷水解酶家族，可催化蔗糖發生水解和聚合2種主要反應，其中聚合反應可將蔗糖轉化為高附加值的左聚糖。廣西甘蔗資源豐富，但行業產品種類較少，缺乏高附加值的蔗糖深加工產品，易受國外糖制品和甜味劑沖擊，限制了蔗糖工業的發展（侯佳，2014）。左聚糖蔗糖酶是利用蔗糖生產左聚糖的關鍵酶，具有重要的開發價值。因此，通過克隆表達新的高性能左聚糖蔗糖酶，并優化聚合反應條件，提高蔗糖的轉化率，對將來規模生產左聚糖具有重要意義。【前人研究進展】目前制備左聚糖的方法主要有4種，分別為從植物中提取、化學合成、微生物發酵和酶法合成（王涵等，2009）。相對而言，酶法合成左聚糖具有制備方法簡單、純化方便、產量較高等優勢。近年來，左聚糖的研究熱點主要集中在細菌產左聚糖的生物合成及其應用的多樣性（Ortiz-Soto et al.，2019）。已有研究表明，不同微生物來源左聚糖蔗糖酶的酶學性質和產物性質有所不同（Srikanth et al.，2015;González-Garcinu et al.，2017）。多數已報道的左聚糖蔗糖酶催化聚合反應的熱穩定性欠佳（Han et al.，2009;Xu et al.，2018）。Méndez-Lorenzo等（2015）研究證實枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis 168）的左聚糖蔗糖酶產左聚糖溫度為25 ℃。已有報道中，蔗糖轉化率較高的是來自地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）的左聚糖蔗糖酶，其在10%底物濃度時轉化率可達40%以上（陸娟等，2013）;但也有研究表明左聚糖蔗糖酶在高底物濃度下左聚糖合成減弱，而制約其生產應用（Lorenzetti et al.，2015;?ner et al.，2016）。例如一種納豆芽孢桿菌（B. subtilis natto）左聚糖蔗糖酶在蔗糖濃度超過25%以上時則不利于聚合反應（Bersaneti et al.，2018）。【本研究切入點】從耐熱微生物中克隆獲得熱穩定性好、耐高底物濃度且轉化率高的左聚糖蔗糖酶是提高左聚糖產量的關鍵，但目前同時具備這3種性質的左聚糖蔗糖酶較少。【擬解決的關鍵問題】通過基因工程和酶工程的方法，獲得熱穩定性好、且在50%高底物濃度下蔗糖轉化率達35%以上的左聚糖蔗糖酶，從而為提高左聚糖生產效率和降低生產成本提供技術基礎。

1 材料與方法

1. 1 試驗材料

Bacillus paralicheniformis LN-05由廣西微生物與酶工程技術研究中心實驗室從市售菌肥中篩選獲得并保存，大腸桿菌（Escherichia coli）XL-10感受態細胞購自北京百奧萊博科技有限公司，質粒pSE380購自Invitrogen公司。Eazy Taq DNA聚合酶購自北京聚合美生物科技有限公司，T4 DNA連接酶、限制性內切酶（PstⅠ、NcoⅠ）、λDNA/Hind Ⅲ DNA Marker、DL2000 DNA Marker、蛋白標準分子量、DNA標準分子量和dNTPs均購自寶日醫生物技術（北京）有限公司;柱式質粒DNA小量抽提試劑盒、柱式膠回收試劑盒和柱式PCR產物純化試劑盒均購自生工生物工程（上海）股份有限公司;酵母粉和胰蛋白胨購自英國Oxoid公司;其他試劑均為國產分析純。

LB培養基：蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L。LB瓊脂平板：蛋白胨10.0 g/L，酵母提取物5.0 g/L，NaCl 10.0 g/L，瓊脂15 g/L。

1. 2 試驗方法

1. 2. 1 菌株16S rDNA序列分析 鑒定提取待測菌基因組，通過通用引物擴增其16S rDNA序列（Erden-Karao?lan et al.，2019），送至廣州華大基因科技有限公司測序，將測序結果在NCBI數據庫進行BLAST比對分析，并構建系統發育進化樹。

1. 2. 2 左聚糖蔗糖酶克隆 根據已公開的地衣芽孢桿菌左聚糖蔗糖酶基因序列（Nakapong et al.，2013）設計引物（F-primer：5'-GATCCATGGTGAAC ATCAAAAACATTGCTAAAAAAGCGTCAGCCTT AACCGCG-3'，R-primer：5'-CGCGCTGCAGTTAAT GATGATGATGATGATGTTTGTTTACCGTTAGTT TCCCTG-3'），其中下游引物加入6個組氨酸標簽。以目的菌全基因組為模板進行PCR擴增。PCR反應體系如下：DNA 1.0 ng，上、下游引物（10 mmol/L）各1.0 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4.0 μL，Easy Taq DNA聚合酶0.8 μL，10×Easy Taq Buffer 5.0 μL，ddH2O補足至50.0 μL。擴增程序：95 ℃預變性3 min;95 ℃ 1 min，55 ℃ 30 s，72 ℃ 4 min，進行24個循環; 72 ℃延伸10 min。

1. 2. 3 重組質粒構建 擴增獲得的左聚糖蔗糖酶基因產物經柱式PCR產物純化試劑盒純化，再以NcoⅠ和PstⅠ雙酶切處理后，連接到經相同雙酶切的原核表達載體pSE380上，得到含目的基因的重組質粒，轉化XL-10感受態細胞，挑取陽性重組菌送至廣州華大基因科技有限公司進行測序，測序結果在NCBI數據庫上進行核苷酸序列及推導氨基酸序列比對分析。

1. 2. 4 重組左聚糖蔗糖酶表達 將含有pSE380-Lev重組質粒的XL-10重組菌株接種到含有100 μg/mL氨芐青霉素的LB液體培養基中，37 ℃、220 r/min過夜活化，次日以1%～2%的接種量轉接到含有相同抗生素的LB液體培養基中，37 ℃下220 r/min培養3～4 h;當OD600達0.6～0.8時加入終濃度0.8 mmol/L的異丙基硫代半乳糖苷（IPTG），置于24 ℃下220 r/min誘導產酶18 h。

1. 2. 5 重組左聚糖蔗糖酶純化 取1 L重組左聚糖蔗糖酶的誘導表達培養液，8000 r/min離心15 min，收集菌體，用ddH2O重懸清洗，再用相同條件離心，用5 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 8.0）重懸細胞置于冰水浴，超聲波39 W 1 h，間或5 s工作破胞，破胞液經12000 r/min離心15 min，取上清液。用鎳柱純化方式進行提純操作（Hernandez et al.，1995），洗脫液樣品采用SDS-PAGE電泳檢測。

1. 2. 6 重組左聚糖蔗糖酶酶學性質研究

1. 2. 6. 1 水解活力測定 用DNS法（楊輝，2012）測定左聚糖蔗糖酶水解活力。1個酶活力單位（U）定義為：在最適溫度和pH條件下，1 min催化蔗糖轉化為1 μmol葡萄糖所需左聚糖蔗糖酶的量（Belghith et al.，2012），以各反應條件下最大活力值為100%計算相對活力。

1. 2. 6. 2 聚合活力測定 取490 μL含適當濃度蔗糖的50 mmol/L磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液（pH 5.0），加入稀釋適當倍數的酶液10 μL，在所需溫度下溫浴反應24 h后取出;在反應體系中加入3倍體積無水乙醇終止反應，4 ℃靜置24 h后，12000 r/min離心25 min;用蒸餾水重懸沉淀，再次離心，直至用DNS顯色法檢測上清液無還原糖殘留。所得左聚糖沉淀烘干至恒重稱量，計算蔗糖轉化率和左聚糖產量，以各反應條件下最高產量值為100%計算相對活力。

1. 2. 6. 3 水解反應最適溫度和最適pH測定 將純化的酶液稀釋適當倍數（稀釋至適合檢測的濃度范圍），分別在25～55 ℃下反應測定最適溫度;同時在pH 3.5～7.0的緩沖液中反應測定最適pH。

1. 2. 6. 4 水解活力的熱穩定性和pH穩定性測定

將重組左聚糖蔗糖酶保溫在不同溫度（40～55 ℃）下，每隔30 min取樣在最適溫度下測定酶活力，考察熱穩定性。在pH 3.5～7.0的一系列梯度緩沖液中水浴30 min，以最適pH和溫度下的酶活力為參照，確定其pH穩定性。

1. 2. 6. 5 金屬離子和EDTA對水解活力的影響 以pH 6.0的磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液為對照，分別用含終濃度為2.5mmol/L的Cr3+、Co2+、Ag3+、Cu2+、Ba2+、Mg2+、Al3+、K+、Mn2+和Fe2+緩沖液及含有0～120 mmol/L不同梯度的EDTA緩沖液稀釋重組左聚糖蔗糖酶，于4 ℃下放置12 h后按標準酶活力測定方法測定殘余酶活力。

1. 2. 6. 6 水解活力的動力學參數測定 采用雙倒數作圖法制作Linewaver-Burk曲線，求出水解反應的米氏常數（Km）和最大反應速率（Vmax）。

1. 2. 6. 7 聚合反應的最適溫度和最適pH測定 將磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液分別在25～55 ℃的水浴鍋內保溫5 min后，在對應溫度下反應24 h后按照乙醇提取法獲得左聚糖（Santos-Moriano et al.，2015），測定最適溫度。在pH 3.5～7.5的緩沖液保溫30 min，測定最適pH。

1. 2. 6. 8 聚合活力的熱穩定性和pH穩定性 將重組左聚糖蔗糖酶保溫在不同溫度（35～50 ℃）下，每隔30 min取樣并反應24 h，在最適pH和溫度下考察其熱穩定性。將重組左聚糖蔗糖酶在pH 3.5～7.5的緩沖液中保溫30 min，在最適pH和溫度下確定其pH穩定性。

1. 2. 6. 9 不同金屬離子和化學試劑對聚合活力的影響 以pH 5.0的磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液為對照，分別用含終濃度為2.5 mmol/L的Cr3+、Co2+、Ag3+、Cu2+、Ba2+、Mg2+、Al3+、K+、Mn2+和Fe2+緩沖液及含0～120 mmol/L不同梯度的EDTA緩沖液稀釋重組左聚糖蔗糖酶，4 ℃放置12 h后，在最適pH和溫度下考察金屬離子和化學試劑對其聚合活力的影響。

1. 2. 6. 10 蔗糖濃度、酶濃度和反應時間對聚合活力的影響 用50 mmol/L磷酸氫二鈉—檸檬酸緩沖液（pH 5.0）配制10%～50%的蔗糖溶液，重組左聚糖蔗糖酶濃度0.8 U/mL，35 ℃下保溫5 min后反應24 h，測定底物濃度對重組左聚糖蔗糖酶聚合活力的影響;在最適底物濃度和酶濃度條件下，將反應液35 ℃保溫5 min，反應4～40 h后提取左聚糖，測定反應時間對其聚合活力的影響;在最適底物濃度和35 ℃條件下保溫5 min，分別加入0.3～1.5 U/mL的重組左聚糖蔗糖酶反應24 h后，測定酶濃度對其聚合活力的影響。

1. 2. 6. 11 不同溫度和底物蔗糖濃度對左聚糖蔗糖酶的影響 取蔗糖濃度20%～50%的緩沖液在35～50 ℃下反應24 h，測定重組左聚糖蔗糖酶的聚合活力。

1. 3 統計分析

采用Excel 2013對試驗數據進行統計分析，以Origin 8.5制圖。

2 結果與分析

2. 1 菌株 LN-05的16S rDNA序列分析結果

從菌肥中分離出的菌株LN-05經16S rDNA序列分析及構建系統發育進化樹（圖1），結果表明，菌株LN-05的16S rDNA序列與目前已公布B. paralicheniformi Bac48（Dunlap et al.，2015）的16S rDNA序列相似性達99.7%，可初步鑒定該菌株為B. paralicheniformis。

2. 2 重組左聚糖蔗糖酶基因克隆、表達及純化結果

從菌株LN-05基因組中擴增左聚糖蔗糖酶基因，得到大小約1400 bp的擴增產物（圖2）。經廣州華大基因科技有限公司測序，發現其氨基酸序列與已公布地衣芽孢桿菌RN-01的左聚糖蔗糖酶存在19個氨基酸殘基差異（圖3）。重組酶誘導表達后，經鎳親和層析純化再進行SDS-PAGE電泳，結果如圖4所示，重組蛋白分子量約53 kD，與理論值53.8 kD較符合。

2. 3 重組左聚糖蔗糖酶酶學性質分析結果

2. 3. 1 溫度對重組左聚糖蔗糖酶的影響 由圖5可知，重組左聚糖蔗糖酶以蔗糖為底物的水解反應最適溫度為45 ℃，溫度超過50 ℃后水解活力快速下降。而底物濃度為20%時的聚合反應最適溫度為35 ℃，當溫度超過35 ℃后，聚合活力逐步下降。由于該重組酶的水解與聚合反應機制有差異，故其最適反應溫度并不一致，高溫下聚合反應減弱，更傾向水解反應。

2. 3. 2 pH對重組左聚糖蔗糖酶的影響 由圖6可知，重組左聚糖蔗糖酶水解反應的最適pH為6.0，當pH大于6.0時其水解活力快速下降;聚合反應的最適pH為5.0，當pH大于5.0時隨著pH的升高，重組左聚糖蔗糖酶的聚合活力不斷下降，當pH達7.5時，左聚糖產量僅為18.73±0.73 g/L。

2. 3. 3 重組左聚糖蔗糖酶的熱穩定性 由圖7-A可知，重組左聚糖蔗糖酶的水解活力在40和45 ℃時具有較好的熱穩定性，保溫3 h的殘余酶活力分別仍有89%和78%;當溫度超過45 ℃時，該酶的熱穩定性較差。由圖7-B可知，重組左聚糖蔗糖酶的聚合活力在35 ℃時具有良好的熱穩定性，保溫3 h后殘余酶活力為74%，40 ℃時聚合活力半衰期仍保持在45 min左右。

2. 3. 4 重組左聚糖蔗糖酶的pH穩定性 由圖8可知，重組左聚糖蔗糖酶水解活力在pH 4.5～6.0范圍內具有較好的pH穩定性，當pH大于6.0時pH穩定性較差，且隨著pH不斷升高，水解活力的pH穩定性快速下降;當pH為5.0時，重組左聚糖蔗糖酶的聚合活力具備較好的pH穩定性，當pH大于5.0時隨著pH的升高其穩定性逐漸變差，當pH達7.5時左聚糖產量僅為8.78±0.70 g/L。

2. 3. 5 金屬離子對重組左聚糖蔗糖酶的影響 由圖9可知，Mn2+、Ag3+和Cr3+對重組左聚糖蔗糖酶的水解活力有明顯抑制作用，而Co2+和Al3+具有促進作用，水解活力較對照分別提高14%和11%;Ag3+、Cu2+和K+對重組左聚糖蔗糖酶聚合活力具有一定的促進作用，Ba2+、Mg2+和Mn2+則具有明顯的抑制作用，分別抑制聚合活力32%、28%和34%。

2. 3. 6 EDTA對重組左聚糖蔗糖酶的影響 由圖10可知，隨著EDTA濃度的增加，重組左聚糖蔗糖酶的水解活力和聚合活力均不斷下降，EDTA濃度達120 mmol/L時的水解活力為58.09±0.03 U/mL，下降了66%;左聚糖產量為73.69±0.31 g/L，下降了66.2%。說明重組左聚糖蔗糖酶需要金屬離子激活。

2. 3. 7 重組左聚糖蔗糖酶的Linewaver-Burk圖 通過Linewaver-Burk雙倒數作圖（圖11），得到米氏擬合方程為y=0.14565x+0.01351（R?=0.9927），Vmax=74 μmol/（min·mg），Km為7.57 mmol/L，表明該重組左聚糖蔗糖酶具有較快的反應速度和較好的底物親和性。

2. 3. 8 底物濃度、反應時間和酶濃度對重組左聚糖蔗糖酶聚合活力的影響 底物蔗糖濃度明顯影響左聚糖的合成，本研究的重組左聚糖蔗糖酶對底物濃度耐受性較高，由圖12-A可知，當蔗糖濃度為50%時，重組左聚糖蔗糖酶聚合活力最高，左聚糖產量達176.00±0.80 g/L;當底物濃度為50%，最適pH條件下的最適反應時間為24 h（圖12-B），最適聚合反應的酶濃度為0.9 U/mL（圖12-C）。在最適聚合反應條件（50%蔗糖溶液、酶濃度0.9 U/mL、35 ℃、pH 5.0、反應24 h）下其蔗糖轉化率為（36.60±0.80）%，左聚糖產量為183.20±4.10 g/L。

2. 3. 9 不同溫度和蔗糖濃度對重組左聚糖蔗糖酶聚合活力及轉化率的影響 底物濃度影響重組左聚糖蔗糖酶聚合活力的耐熱性，當蔗糖濃度為20%～40%時，其最適聚合反應溫度為35 ℃，而蔗糖濃度達50%時的最適聚合反應溫度上升至40 ℃，此時左聚糖產量達最大值，為183.00±1.73 g/L（圖13-A），并保持較高的轉化率（36.76±1.84）%（圖13-B）。說明底物濃度較高時可對重組左聚糖蔗糖酶起到一定的保護作用。但從蔗糖轉化率來看，底物濃度40%、35 ℃反應時可達最高轉化率，為（39.80±2.95）%。

3 討論

由于耐熱菌的最適生長溫度較高，致使其代謝酶系通常也具有較高的熱穩定性，因此從耐熱微生物尋找耐熱酶很有意義。本研究首次克隆來自耐熱菌B. paralicheniformis的左聚糖蔗糖酶基因，重組左聚糖蔗糖酶在50%底物濃度下的最適聚合溫度達40 ℃，雖然與嗜熱芽孢桿菌（Bacillus sp. TH4-2）（Ammar et al.，2002）和地衣芽孢桿菌RN-01（Nakapong et al.，2013）的50 ℃有差距，但高于目前多數已報道其他菌種的左聚糖蔗糖酶。例如，來源于枯草芽孢桿菌（B. subtilis NRC 33a）的左聚糖蔗糖酶在30 ℃時果糖轉化為左聚糖的效果最佳（Abdel-Fattah et al.，2005）;來源于運動發酵單細菌（Zymomonas mobilis）的左聚糖蔗糖酶在4 ℃下反應時左聚糖產量最高，而在40 ℃下反應時左聚糖產量明顯降低，低聚果糖的含量卻很高（Santos-Moriano et al.，2015）。值得注意的是，菌株LN-05與地衣芽孢桿菌RN-01的左聚糖蔗糖酶氨基酸序列雖然高度相似，但在高底物濃度下兩者的最適聚合反應溫度相差10 ℃，且本研究中的重組左聚糖蔗糖酶最適聚合pH為5.0，而后者為6.0;Mn2+對后者的聚合反應有促進作用，但對本研究中的重組左聚糖蔗糖酶表現為抑制作用。氨基酸序列分析結果表明，本研究的B. paralicheniformis左聚糖蔗糖酶與地衣芽孢桿菌RN-01的左聚糖蔗糖酶僅存在19個氨基酸殘基的差異，但導致明顯的酶學性質變化，說明這些差異氨基酸殘基中可能包含顯著影響聚合反應性能及熱穩定性的關鍵氨基酸殘基，有待進一步通過定點突變技術加以分析，并借此對左聚糖蔗糖酶進行分子改造，使其酶學性能進一步提高。

此外，許多研究表明高底物濃度不利于左聚糖合成。例如，來源于丁香假單胞菌（Pseudomonas syringae pv. Phaseolicola）的左聚糖蔗糖酶在較高底物濃度條件下水解反應優先左聚糖的形成，蔗糖濃度超過10%時，左聚糖產量開始下降（Hettwer et al.，1995）;運動發酵單胞菌（Z. mobilis B-14023）來源的左聚糖蔗糖酶在28 ℃、30%蔗糖濃度條件下左聚糖產量最高，當蔗糖濃度高于30%時，隨著碳源濃度的增加，左聚糖的合成逐漸減少（Silbir et al.，2014）。本研究的重組左聚糖蔗糖酶在40 ℃、底物濃度50%的條件下合成左聚糖的蔗糖轉化率仍為（36.76±1.84）%，說明該酶具有良好的熱穩定性和較強的底物濃度耐受性，即具有較高的生產應用潛力。但以產量為基準的最適反應條件下，轉化率并不是最高，說明酶的性能仍有提升空間，今后在酶分子改造和高底物下酶促反應機制方面還值得深入研究。

4 結論

B. paralicheniformis左聚糖蔗糖酶的熱穩定性較好，左聚糖產量高，具有轉化蔗糖生產高附加值左聚糖的應用潛力。

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（責任編輯 羅 麗）

收稿日期：2020-04-07

基金項目：廣西自然科學基金項目（2017GXNSFAA198128）;南寧市科學研究與技術開發計劃項目（20141015）

作者簡介：*為通訊作者，楊輝（1972-），博士，高級工程師，主要從事食品發酵和酶工程方面研究工作，E-mail：huiy422@gxu.edu.cn。叢豪（1997-），研究方向為發酵與酶工程應用，E-mail：www.hao97.cn@qq.com