基質金屬蛋白酶9與缺血性腦卒中的研究進展

楊佳蕾，尹世敏，陳華蕾

1.國家神經系統疾病臨床醫學研究中心，北京 100070；2.火箭軍特色醫學中心，全軍腦卒中醫療救治研究中心 神經內科，北京 100088；3.首都醫科大學附屬北京地壇醫院 腫瘤診治中心，北京100015

卒中是我國居民的第一位死亡原因，也是傷殘調整生命年的首要原因以及壽命損失年的主要原因之一。卒中可以分為缺血性腦卒中和出血性腦卒中，其中缺血性腦卒中約占87%[1]。缺血性腦卒中的損傷機制尚未完全清楚，主要與缺血缺氧后血腦屏障破壞、炎性反應、細胞死亡、興奮性毒性物質釋放、細胞內鈣超載及氧化應激等有關。基質金屬蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）在神經發生、神經細胞遷移、突觸生長、髓鞘形成、血管生成、神經損傷后修復再生等過程中發揮了重要作用。在不同生理和病理條件下，各種刺激因素如生長因子、細胞因子和活性氧等都可以影響MMPs的表達及活性[2]。在缺血性腦卒中后，MMPs的表達譜發生變化，并且參與破壞血腦屏障（blood-brain barrier，BBB），導致神經細胞死亡、炎性反應、腦水腫、腦出血、髓鞘降解以及神經功能缺損[3]。在MMPs家族中，MMP-9的作用尤為顯著。本文對MMP-9在缺血性腦卒中的損傷及修復中的作用機制進行綜述，以期為缺血性腦卒中提供新的診療靶點。

1 MMP概述

MMPs是一類鋅依賴性內肽酶，可降解幾乎所有的細胞外基質（extracellular matrix，ECM）成分，其作用底物十分廣泛，包括趨化因子、生長因子及其結合蛋白、蛋白酶、蛋白酶抑制劑以及細胞內蛋白，從而起到相應的生理病理作用[4]。人體內表達的MMPs多達25種，其結構從N端到C端包括以下5個部分，即信號肽、前肽、催化結構域、鉸鏈區和血紅素結合蛋白樣C端區[5]。MMPs可以廣義地分為組織型（如MMP-2及MMP-14）和誘導型（MMP-3及MMP-9）。根據MMPs的結構和底物特異性，可進一步分為以下幾種亞型，即明膠酶（gelatinases）、膠原酶（collagenases）、間質溶解素（stromelysins）、基質溶解素（matrilysins）、膜型 MMP（membrane-type MMP，MT-MMP）和其他類型MMP。MMP-9是MMPs亞家族中的一種，又稱為明膠酶B（gelatinase B）。人MMP-9由染色體20q13.12基因編碼表達，其酶原的相對分子質量為92 000，經過剪切后其活性形式的相對分子質量為83 000。MMP-9可以由中性粒細胞、巨噬細胞、血管內皮細胞等分泌，主要在細胞外空間起作用。MMP-9可以分解Ⅳ型膠原蛋白、Ⅴ型膠原蛋白、彈性蛋白、纖維連接蛋白、變性間質蛋白等多種ECM成分，在組織發育、損傷與修復中起重要作用[6-7]。

2 MMP-9與缺血性腦卒中

MMP-9在正常腦組織中低表達，但在缺血性腦卒中后表達增加，通過破壞BBB、促進炎性細胞浸潤及炎性因子釋放、誘發神經細胞死亡、缺血組織出血轉化等諸多機制參與腦組織損傷。

2.1 MMP-9與血腦屏障

BBB是中樞神經系統和外周組織的物理屏障，由內皮細胞及其緊密連接、周細胞、星形膠質細胞足突以及基膜構成，可以阻礙毒性物質、炎癥因子、炎細胞進入中樞神經系統，從而維持腦內環境穩定。構成BBB的蛋白質分子如緊密連接蛋白、轉運蛋白、白細胞黏附分子、基底膜蛋白等，對調控其通透性起重要作用[8]。在腦缺血早期，MMP-9主要由中性粒細胞分泌，之后以小膠質細胞和巨噬細胞為主。缺血區局部的神經元、血管內皮細胞和神經膠質細胞也可過表達MMP-9[9-10]。腦缺血后4～6 h MMP-9活性顯著升高，48 h達到高峰，72 h或更長時間恢復至基線水平。由于動物研究模型不同，MMP-9改變的時程也有所變化，但既往研究報道MMP-9的活性增加時程與血腦屏障降解、通透性增加密切相關[9-11]。

真核細胞中存在由纖維蛋白網構成的細胞骨架，可以維持細胞形態并影響細胞運動，其中由肌動蛋白構成的微絲具有細胞連接與屏障功能。腦組織缺血缺氧誘導MMP-9表達上調可以導致血管內皮細胞中的微絲發生斷裂或重構，進而增加BBB的通透性[12]。MMP-9在分解BBB基底膜蛋白的同時，降低了血管內皮細胞間緊密連接蛋白的表達，導致血管源性水腫、出血轉化和死亡率增加[13-14]。MMP-9還可以誘導免疫炎癥反應，調控各種細胞因子和炎癥趨化因子活性，如TNF-α、ICAM-1、CXCL12等[7,15]。與此同時，促炎因子迅速激活腦內組織型免疫細胞即小膠質細胞，并廣泛募集炎癥細胞，如中性粒細胞、單核細胞/巨噬細胞、不同亞型的T細胞和其他炎性細胞。其中，中性粒細胞最早滲入腦組織并釋放MMP-9[11]。但是，既往研究表明，中性粒細胞可以表達癌胚抗原相關細胞黏附分子1（carcinoembryonic antigen-related celladhesion molecule 1，CEACAM1）。采用CEACAM1敲除小鼠制作腦缺血模型，分泌MMP-9的中性粒細胞增加導致血腦屏障破壞加劇。由此可見調控CEACAM1+中性粒細胞與分泌MMP-9的中性粒細胞的亞群平衡可能成為治療靶點[16]。周細胞是神經血管單元的組成部分，對維持BBB完整性起重要作用。既往研究結果證明，缺血性腦卒中早期周細胞是神經血管單元中最易受損且最早死亡的細胞，其死亡可以直接導致BBB完整性受損。另一方面，在體雙光子成像顯示，血管內血液外滲主要發生在周細胞胞體與毛細血管壁密切接觸的部位，而這一分布不均勻的滲漏主要與周細胞分布不均以及周細胞在炎癥刺激下分泌的MMP-9有關[17-18]。由此可見，缺血性腦卒中后MMP-9可通過多種途徑直接或間接破壞BBB、增加血管通透性，同時缺血灶局部產生的趨化因子促使血液循環中的炎細胞浸潤，加重炎癥反應引起的組織損傷，故MMP-9介導的BBB破壞是引起腦缺血損傷的重要機制之一。

2.2 MMP-9與神經細胞死亡

MMP-9介導的神經元凋亡與ECM的破壞有關。ECM是由膠原蛋白、彈性蛋白、纖維連接蛋白和蛋白聚糖組成的非細胞性三維分子網絡。ECM不僅為神經細胞提供物理支撐，還能夠調節細胞生存、生長、遷移和分化[19]。在腦缺血后，過表達的MMP-9降解ECM，進而破壞神經細胞與ECM間的相互作用，使其與ECM的黏附性下降并脫離，激活死亡受體介導的外源性信號通路或線粒體參與的內源性信號通路，導致神經元凋亡。這種由于細胞與ECM分離或相互作用發生異常而誘發的細胞程序性死亡又稱為失巢凋亡[20]。除此之外，腦缺血后產生的一氧化氮介導S-亞硝基化（S-nitrosylation）反應激活MMP-9可以直接引起神經元凋亡，而給予MMP抑制劑GM6001或明膠酶抑制劑SB-3CT可以阻斷神經元凋亡、減小腦梗塞體積、改善神經功能[21-22]。除了局灶腦缺血可以引發大量神經元凋亡，全腦缺血后部分區域如海馬、皮層特定亞層也會發生選擇性神經元死亡。在全腦缺血后，海馬MMP-9表達顯著上調，而采用廣譜MMP抑制劑BB-94或敲除MMP-9后神經元死亡顯著減少[23]。上述研究表明，MMP-9可以通過直接或間接途徑誘導神經細胞死亡，局灶給予MMP-9特異性抑制劑可能為減少神經元死亡、減輕神經功能損傷提供新的治療方法。

2.3 MMP-9與出血轉化

出血轉化是缺血性腦卒中的嚴重并發癥，可以引起神經功能的突然惡化，既往研究提示MMP-9的過表達與出血轉化關系密切。對于急性腦出血且未采用重組組織型纖溶酶原激活劑（recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA）溶栓的患者，有研究對比了出血轉化及非出血轉化患者血漿中MMP-9的含量，發現出血轉化組外周血MMP-9的含量明顯升高，并且通過多因素分析校正其他危險因素發現，急性腦出血患者發病24 h內血漿MMP-9水平可以作為發生腦缺血后出血轉化的獨立預測因素[24-25]。對于急性腦出血且采用rt-PA的患者，rt-PA在改善卒中預后的同時，也在一定程度上增加了出血轉化的風險。rt-PA靜脈溶栓前，患者外周血MMP-9水平不但是溶栓后出血轉化最強有力的預測因子，并且其水平高低與出血轉化程度有明確相關性[26]。既往有前瞻性研究驗證了溶栓前MMP-9≥140 ng/mL可以預測rt-PA靜脈溶栓后的出血轉化事件[27]。機制研究提示，rt-PA可以通過低密度脂蛋白受體相關蛋白（low-density lipoprotein receptor related protein，LRP）上調人腦微血管內皮細胞的MMP-9 mRNA，進而增加蛋白水平，破壞BBB并導致出血轉化[28]。除此之外，諸多基礎疾病如高血壓、糖尿病和血脂異常等均可以損傷血管內皮細胞并降低連接完整性，促進溶栓治療后MMP-9誘導的血管破裂。綜上，MMP-9可以預測出血轉化發生風險，有助于評價溶栓治療安全性，與MMPs抑制劑的聯合使用可在一定程度上減少出血轉化并改善預后。

2.4 MMP-9與基質金屬蛋白酶組織抑制因子

基質金屬蛋白酶組織抑制因子（tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP）可與 MMPs結合并抑制其活性。目前已發現的TIMP家族成員包含TIMP-1～TIMP-4，每種TIMP以非特異的方式與MMPs進行1∶1結合，形成TIMP-MMP復合物，通過與MMP活性位點的Zn2+相互作用激活其水解過程。4種TIMP對MMP-9均有抑制作用，其中TIMP-1的作用尤為顯著。采用TIMP-1過表達轉基因鼠制作腦缺血模型，其MMP-9水平顯著低于野生型小鼠，BBB損傷及梗塞程度均減輕；反之，采用TIMP-1敲除小鼠制作腦缺血模型，可以引起MMP-9活性增加，進而加重組織損傷[29]。TIMPs/MMPs表達平衡還與缺血損傷程度及并發癥發生風險有關。采用小鼠大腦中動脈梗塞再灌注及rt-PA溶栓模型發現，在腦缺血后不同時段，TIMPs與MMPs蛋白表達譜發生變化，而rt-PA的使用可以導致TIMPs/MMPs含量失衡[30]。TIMPs作為MMPs的內源性抑制劑，具有一定的腦保護作用，可以為新藥研發提供重要思路。

3 治療

目前，已經有較多研究探討了抑制MMPs以減輕腦組織損傷的治療方法，如MMPs抑制劑SB-3CT、BB-1101、Ro28-2653等。SB-3CT是一種競爭性MMP-2和MMP-9的雙重抑制劑，可減輕局灶性缺血性腦損傷。BB-1101是一種廣譜MMPs抑制劑，可以在減輕DNA氧化損傷的同時，保護BBB的緊密連接，防治出血轉化并發癥。Ro28-2653是一種新型廣譜MMPs抑制劑，可以在腦缺血48 h顯著減輕腦損傷[5]。除了MMPs抑制劑，物理療法（無創性迷走神經刺激、常壓高氧治療、局部低溫治療等）、臨床藥物（如去甲斑蝥素、米諾環素、黃體酮等）、化合物（L-902、前列腺素EP4受體激動劑688、尼克酰胺單核苷酸等）以及中藥提取物都有一定的MMPs抑制作用，羥肟酯類抑制劑、非羥肟酸鹽抑制劑以及針對結合位點的藥物和免疫治療也已取得了進展[31]。深入認識MMPs在腦缺血損傷機制中的作用，有助于研發新的神經保護策略，為探索更安全、有效的治療方法奠定基礎。