植物乳桿菌培養基的優化

高玉榮，李大鵬，張鳳琴，方 舒，彭 貞，宋俊梅

（巢湖學院化學與材料工程學院，安徽合肥 238000）

0 引言

隨著人們生活水平的提高，開發富含益生菌等具有改善人體健康功能的食品已經成為食品行業的重要發展方向之一[1]。研究表明，植物乳桿菌是一種重要的益生菌，能分泌抗生物素類物質，對腸道致病菌產生的拮抗作用，從而對人體產生益生作用[2]。除此之外，某些益生菌還具有同化膽固醇、提高免疫力、抗氧化等特殊保健功能[3]。

為了更好地發揮益生菌的保健功能，必須獲得大量的益生菌活細胞。高密度培養技術是目前獲得高活菌數的有效方法。高密度培養技術是指微生物菌體在液體培養基中培養后其細胞密度達到常規培養的10倍以上的生長狀態[4]。一些學者對提高益生菌活細胞數的培養基及培養條件進行了研究，取得了一定的研究進展[5-6]。

前期試驗從發酵食品中分離篩選到一株具有體外降膽固醇、降甘油三酯功能的益生菌植物乳桿菌G1-28。為了更好地發揮植物乳桿菌G1-28的益生作用、獲得大量的活細胞，試驗以營養肉湯為基礎培養基，對植物乳桿菌G1-28的培養基進行了研究和優化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種

植物乳桿菌G1-28，從發酵食品中分離的具有體外降膽固醇和甘油三酯功能的益生菌，于巢湖學院食品工程實驗室保藏。

1.1.2 試劑

MRS培養基，北京奧博星生物技術有限責任公司提供；氫氧化鈉、葡萄糖、果糖、乳糖、淀粉、蛋白胨、酵母浸粉、硫酸銨、硝酸鈉、牛肉膏、硫酸鎂、氯化鈉、鹽酸，均為分析純。

1.1.3 儀器設備

TU-1810型紫外分光光度計，北京普析通用儀器有限公司產品；LDZM-80KCs-III型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠產品；PHB-401型PH計，上海天達儀器有限公司產品；SHP-160型智能生化培養箱，上海三發科學儀器有限公司；TG16Ws型臺式高速離心機，湘儀離心機儀器有限公司產品；SWCJ-2F型潔凈工作臺，蘇州市智拓凈化設備科技有限公司產品。

1.2 試驗方法

1.2.1 菌種活化及培養

將-20℃甘油管保藏的菌種，按照1%的接種量接入10 mL已滅菌的MRS液體培養基中，于37℃下靜置培養12～14 h進行活化。然后，按照1%的接種量接入裝有50 mL已滅菌的MRS液體培養基中，于37℃下靜置培養12～14 h備用。

1.2.2 植物乳桿菌培養基的單因素試驗

（1）碳源的選擇及其質量分數的確定。以營養肉湯培養基為基礎培養基，分別以1%的葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、淀粉代替其中的碳源，培養后測定其對植物乳桿菌G1-28生長的影響。培養條件為初始pH值6.0，接種量2%，于30℃下靜置培養16 h（下同）。以氮源1%，NaCl 0.5%為基礎，研究0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%碳源對植物乳桿菌G1-28生長的影響。

（2）氮源的選擇及其質量分數的確定。以營養肉湯培養基為基礎培養基，分別以1%的蛋白胨、酵母浸粉、硫酸銨、硝酸銨、牛肉膏替代其中的氮源，培養后測定其對植物乳桿菌G1-28生長的影響。在確定的最佳氮源的基礎上，研究0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%的氮源對植物乳桿菌G1-28生長的影響。

（3）硫酸鎂對植物乳桿菌生長的影響。在營養肉湯培養基中分別添加0，0.2‰，0.4‰，0.6‰，0.8‰，1.0‰硫酸鎂，培養后測定其對植物乳桿菌G1-28生長的影響。

（4）番茄汁對植物乳桿菌生長的影響。將新鮮成熟番茄清洗干凈后去蒂去皮，切塊放入榨汁機中壓榨，得到新鮮的番茄汁。添加0，5%，10%，15%，20%新鮮番茄汁，培養后測定其對植物乳桿菌G1-28生長的影響。

1.2.3 植物乳桿菌培養基研究的正交試驗

在單因素試驗的基礎上，進行四因素三水平的正交試驗。

1.2.4 植物乳桿菌生長量的測定

采用平板計數法測定植物乳桿菌活菌數[7]。將菌懸液進行10倍梯度稀釋，從中選擇3個合適的菌懸液各0.1 mL，涂布在制備好的MRS固態培養基平板表面，于37℃下倒置培養24 h，計數平板表面生長的菌落數，乘以稀釋倍數，即為植物乳桿菌G1-28活細胞數。

2 結果與分析

2.1 植物乳桿菌培養基的單因素試驗

2.1.1 碳源對植物乳桿菌生長的影響

（1）碳源種類對植物乳桿菌生長的影響。

碳源種類對植物乳桿菌生長的影響見圖1。

由圖1可知，植物乳桿菌G1-28在以葡萄糖為碳源的培養基中最高，乳糖和果糖相對較低，蔗糖和淀粉最低，表明葡萄糖作為植物乳桿菌G1-28的碳源，能更好地被利用并促進其生長繁殖。

（2）葡萄糖添加量對植物乳桿菌生長的影響。

葡萄糖添加量對植物乳桿菌生長的影響見圖2。

由圖2可知，植物乳桿菌G1-28在葡萄糖添加量為1.5%的培養基中活菌數最高，隨著葡萄糖添加量的增加，活菌數呈現下降趨勢，可能是由于葡萄糖添加量過高會導致菌體呼吸加快，使一些代謝產物不能完全氧化而積累在培養基中，導致培養基中的pH值過低，影響某些酶的活性，不利于植物乳桿菌G1-28的生長。因此，選擇1.5%的葡萄糖作為植物乳桿菌G1-28生長的適宜添加量。

2.1.2 氮源對植物乳桿菌生長的影響

（1）氮源種類對植物乳桿菌生長的影響。氮源種類對植物乳桿菌生長的影響見圖3。

氮源是用于構成菌體細胞物質和代謝產物的氮素來源，通常可以分為有機氮源和無機氮源。由圖3可知，植物乳桿菌在添加酵母浸粉、蛋白胨和牛肉膏等有機氮源的培養基中的活菌數顯著高于添加硫酸銨和硝酸銨等無機氮源的培養基。在有機氮源中酵母浸粉最利于植物乳桿菌G1-28的生長。因此，確定酵母浸粉為植物乳桿菌G1-28生長所需的最佳氮源。

（2）酵母浸粉添加量對植物乳桿菌生長的影響。

酵母浸粉添加量對植物乳桿菌生長的影響見圖4。

由圖4可知，酵母浸粉添加量在0.5%～2.0%時，植物乳桿菌活菌數呈上升趨勢，但當酵母浸粉添加量大于2.0%時則呈下降的趨勢，因此選擇酵母浸粉添加量為2.0%。

2.1.3 硫酸鎂對植物乳桿菌生長的影響

硫酸鎂添加量對植物乳桿菌生長的影響見圖5。

由圖5可知，硫酸鎂對植物乳桿菌G1-28生長的影響顯著，在硫酸鎂添加量為0.3‰的培養基中，活細胞數最大，但當硫酸鎂添加量過大（大于0.3‰）時，不利于植物乳桿菌G1-28的生長。因此選擇硫酸鎂添加量為0.3‰。

2.1.4 番茄汁添加量對植物乳桿菌生長的影響

番茄汁添加量對植物乳桿菌生長的影響見圖6。

番茄汁含有豐富的維生素、微量元素等營養成分可以為乳酸菌提供糖類、礦物質和B族維生素等多種營養成分。由圖6可知，番茄汁添加量對植物乳桿菌G1-28的生長有促進作用。在番茄汁添加量為0～10%的培養基中，植物乳桿菌G1-28活菌數呈增加的趨勢；當番茄汁添加量大于10%時，呈現明顯的下降趨勢，可能是由于番茄汁添加量過高，導致培養基的pH值過低，不利于植物乳桿菌G1-28的生長，因此選擇番茄汁的適宜添加量為10%。

2.2 植物乳桿菌培養基的正交試驗

根據單因素試驗的結果，采用了L9（34）正交試驗。

正交試驗設計見表1，正交驗結果見表2。

表1 正交試驗設計

表2 正交試驗結果

由表4可以看出，各因素對植物乳桿菌G1-28生長的影響次序依次是酵母浸粉添加量＞葡萄糖添加量＞番茄汁添加量＞硫酸鎂添加量。最佳培養基配方為A2B3C2D1，此配方不在正交試驗的9組配方中，因此需要進行驗證試驗。

根據正交試驗所獲得的最優組合培養基成分，即葡萄糖添加量1.5%，酵母浸粉添加量2.5%，硫酸鎂添加量0.3‰，番茄汁添加量5%；在初始pH值6.0，接種量2%，于30℃下靜置培養16 h，進行3次平行試驗，測得植物乳桿菌G1-28活細胞數19.8×109CFU/mL，驗證試驗的活細胞數大于正交試驗中的任一組合的結果，因此確定A2B3C2D1是最優組合。

3 結論

以營養肉湯為基礎培養基，通過單因素試驗研究表明，葡萄糖添加量、酵母浸粉添加量、硫酸鎂添加量、番茄汁添加量對植物乳桿菌G1-28生長影響顯著。

通過正交試驗確定植物乳桿菌G1-28最佳培養基配方為葡萄糖添加量1.5%，酵母浸粉添加量2.5%，硫酸鎂添加量0.3‰，番茄汁添加量5%，在此條件植物乳桿菌G1-28下活細胞數達19.8×109CFU/mL。