熱休克蛋白在脊髓損傷中的研究進展

賀學崗,張廣智,馬占軍,高一誠,郭旭東,康學文*

(1．蘭州大學第二醫院骨科,中國甘肅蘭州730030;2．蘭州大學,中國甘肅蘭州730030)

脊髓損傷(spinal cord injury,SCI)通常是由外力作用于脊柱導致椎體骨折或移位造成的[1],可分為原發性損傷和繼發性損傷。原發性損傷是指外力導致的碎骨片、椎間盤或韌帶等持續壓迫或撕裂脊髓組織[2];繼發性損傷包括原發性損傷所引起的炎癥反應、組織水腫、電解質紊亂、自由基形成、脂質過氧化、神經元凋亡和興奮性毒性神經遞質的積累等[3]。目前關于SCI的治療策略除手術解除壓迫外,主要是限制繼發性損傷的發生發展。

熱休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)是一類在生物體內廣泛存在的具有多種功能且高度保守的蛋白質[4]。當機體處于高溫、炎癥、缺血或氧化應激等狀態時,HSPs作為保護細胞和組織免受進一步傷害的重要分子而大量合成[5]。在細胞內,HSPs主要分布于細胞質、細胞核、線粒體及內質網中,可以促進蛋白質二級和三級結構的形成,參與修復或清除受損變性的蛋白質,并介導信號傳導、細胞凋亡、炎癥反應及氧化應激等病理生理過程[6]。近年來研究發現,HSPs在繼發性脊髓損傷階段起著重要的保護作用,故本文對HSPs在脊髓損傷領域的研究進展予以綜述,為后續相關研究提供參考。

1 熱休克蛋白概述

1962年,Ritossa首次在果蠅唾液腺中發現HSPs,然而直到1986年,人們才逐漸了解其功能,并提出分子伴侶這一概念,它是指一類具有相同功能但序列不同的多肽,可以幫助其他蛋白質正確折疊和組裝[7～9]。HSPs是生物體在應激后高表達的蛋白質之一,生理條件下其在細胞內表達相對較低,占總蛋白質含量的5%～10%,然而在應激情況下其表達可增至15%[10]。HSPs的相對分子質量在15～110 kD,根據相對分子質量的大小可將其分為以下幾類:大分子HSP家族(100～110 kD)、HSP90 家族(83～90 kD)、HSP70 家族(66～78 kD)、HSP60家族、HSP40家族、HSP20家族(15～30 kD)及泛素等[11]。其中,研究最多的是HSP70,它是對應激最敏感的HSPs,具有兩個結構域,在穩定蛋白質、信號傳導、細胞凋亡、炎癥及氧化應激等生理病理過程中起著重要的調控作用[12]。

2 熱休克蛋白與脊髓損傷

繼發性脊髓損傷在原發性損傷發生后的幾分鐘內開始,可持續數周或數月,引起病變部位及周圍脊髓組織的進行性損傷[13]。Allen等[14]在1911年首次提出脊髓的繼發性損傷這一概念。他在研究狗的脊髓損傷時發現,手術清除創傷后的血腫可以改善神經功能,故推測在壞死的出血性損傷中存在一些生化因素會對脊髓造成進一步的損傷,即繼發性脊髓損傷。當然,脊髓損傷后機體也可產生一些保護性分子,促進其神經功能的恢復。相關研究表明,脊髓損傷后HSPs表達升高,并在繼發性脊髓損傷階段發揮著保護受損神經元的關鍵作用[12]。

2.1 脊髓損傷后熱休克蛋白的誘發因素

HSPs在生理情況下表達較低,當機體處于應激狀態時作為保護性分子大量表達[15]。其表達主要由熱休克轉錄因子(heat shock transcription factors,HSFs)介導。HSFs通過其氨基末端結構域與HSPs編碼基因5′端啟動子中的熱休克元件(heat shock element,HSE)序列特異性結合來調控HSPs的表達[16],其中HSF1是調節HSPs表達的必要因子。在生理條件下HSF1與HSPs結合,當細胞處于應激狀態時兩者相互脫離,HSPs發揮作用,而游離的HSF1被蛋白激酶C磷酸化并轉移到細胞核內形成活化的三聚體,活化的三聚體與HSE結合從而生成更多的HSPs[17]。脊髓損傷后機體產生的神經酰胺、活性氧(reactive oxygen species,ROS)及錯誤折疊的蛋白質等可以通過活化HSFs誘導HSPs的表達。

2.1.1 神經酰胺

神經酰胺是一種結構簡單的鞘脂,由長度不等的脂肪酸與鞘氨醇的氨基縮合而成,是細胞膜的結構成分之一[18]。神經酰胺可以作為信號分子,將細胞外壓力轉化為細胞內信號[19]。靜息細胞細胞膜中的神經酰胺水平較低,當受到應激(如SCI)時可顯著增多[20]。在絲氨酸殘基、乙酰轉移酶及調節蛋白作用下,神經酰胺可以將HSFs磷酸化,啟動HSPs的轉錄[21]。Han等[22]研究顯示,Malme-3M黑色素瘤細胞經神經酰胺作用后,其HSP70的表達明顯升高,這提示神經酰胺可以促進HSPs的產生。脊髓損傷后,神經元及膠質細胞等細胞的細胞膜骨架遭到破壞,神經酰胺大量表達,進而激活HSFs,促進HSPs的產生。

2.1.2 活性氧

ROS主要由細胞內線粒體產生,包括超氧陰離子(O2·-)、過氧化氫(H2O2)、羥基自由基(·OH)和一氧化氮(NO)等,是細胞氧化代謝的副產物,正常情況下與體內抗氧化劑處于平衡狀態[23]。在氧化磷酸化過程中,線粒體消耗了細胞90%左右的氧氣(O2);當線粒體功能發生障礙時,電子能與更多的O2結合產生ROS[24]。脊髓損傷后,線粒體結構被破壞,功能發生障礙,ROS生成增加。此外,小膠質細胞、巨噬細胞及中性粒細胞也參與了ROS生成[23]。相關研究表明,H2O2可以直接激活HSF1,從而促進HSP70和HSP90的mRNA表達[25]。Ahn等[26]研究表明,ROS可以體外激活HSFs,HSF1通過H2O2的氧化而被多聚化,并與DNA結合,進一步促進HSPs表達。

2.1.3 蛋白質的錯誤折疊

內質網是蛋白質合成與折疊的場所,SCI可引起內質網功能紊亂,導致蛋白質折疊錯誤。此外,脊髓損傷后增加的ROS也可以誘導蛋白質錯誤折疊。蛋白質的錯誤折疊和聚集可以導致神經毒性累積,并引發炎癥反應和細胞凋亡。正常情況下,細胞可以通過蛋白酶體及自噬系統將錯誤折疊的蛋白質清除[27],當機體不能及時清除時就會誘導c-Jun氨基端激酶2(c-Jun N-terminal kinase 2,JNK2)活化,活化的JNK2可以使HSF1磷酸化,并激活HSF1和HSF2的轉錄活性,從而促進HSPs 的表達[28～29]。

2.2 熱休克蛋白在脊髓損傷后的保護作用

2.2.1 分子伴侶作用

HSPs作為分子伴侶,可以促進蛋白質的正確折疊,同時也可以清除錯誤折疊的蛋白質。HSPs可以與核糖體上新生肽鏈的疏水氨基酸短序列結合,防止新生肽鏈在完全合成之前錯誤折疊,并能阻止相鄰肽鏈上疏水氨基酸間因相互作用而發生的聚集,促進蛋白質的正確折疊。泛素可通過與錯誤折疊的蛋白質相結合而使其泛素化,進而使其被蛋白酶體識別并降解。SCI可導致蛋白質聚集體的錯誤折疊和積累。Cuesta等[30]證明HSP27可以作為細胞蛋白質合成的抑制劑;他們發現,HSP27與一種被稱為eIF4G的轉錄起始因子相互作用,并阻止eIF4G因子啟動翻譯,而eIF4G是大多數細胞RNA轉譯所必需的。這種相互作用可能是一種保護機制,從而進一步限制蛋白質在應激條件下錯誤折疊的積累。在細胞內,細胞骨架的主要功能是維持細胞的正常結構和生長,HSP27可與細胞骨架肌動蛋白微絲結合,從而穩定細胞骨架結構,防止其解體。這可能是對細胞環境變化的適應性反應[31]。

2.2.2 促進血管生成

脊髓損傷后,大的血管如脊髓前動脈通常保持完整,而較小的髓內血管和毛細血管則容易受損,導致白細胞和紅細胞外滲,進而導致炎癥、脊髓能量供應不足、缺氧和隨后的細胞線粒體功能障礙[32]。研究表明,HSPs參與了脊髓損傷后新生血管的形成。一項基于內皮細胞的體外研究發現,HSP27與血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)有著復雜的相互作用。細胞應激后,VEGF通過激活應激活化蛋白激酶2(stress-activated protein kinase 2,SAPK2)/p38途徑促進HSP27的磷酸化,從而使細胞骨架重組和內皮細胞遷移,促進血管新生[33]。此外,HSP27的磷酸化減少了細胞外HSP27的釋放,而細胞外的HSP27可以與VEGF結合,阻止VEGF的表達[34]。HSP27也可以通過與內皮細胞上Toll樣受體3的結合增強細胞內VEGF的表達[35]。因此,HSPs通過與VEGF相互作用,促進脊髓損傷后新生血管的形成。

2.2.3 抑制炎癥反應

脊髓損傷后小膠質細胞、T細胞和星形膠質細胞激活并向損傷部位趨化聚集,同時它們合成并釋放的炎癥因子(TNF-α、IL-1β、IL-6、TGF-β、IL-8等)迅速增多,加重神經元的凋亡和血脊髓屏障的破壞,導致脊髓組織進一步損傷[36]。Kim等[37]在大鼠自身免疫性腦脊髓炎模型中發現,體外應用的HSP27具有抗炎作用。在巨噬細胞中,HSP27可以通過上調核轉錄抑制因子來抑制核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB)的表達,進而阻止巨噬細胞的活化[38]。在單核細胞中,沉默HSP27可以使IL-1的表達增多,這表明HSP27可以通過抑制單核細胞表達IL-1來抑制炎癥反應[39]。Chamney等[40]研究表明,小鼠脊髓損傷后,HSP70的上調可以顯著降低肌肉中IL-6和TNF-α的表達。Huan等[41]發現,寶珍丸可以誘導HSP27的表達,從而降低SCI大鼠Treg細胞比例,進一步減少TGF-β的表達。因此,脊髓損傷后活化的HSPs可通過抑制炎癥因子的表達減緩脊髓組織的進一步受損。

2.2.4 抑制細胞凋亡

脊髓損傷后可以通過激活多個信號通路引起細胞凋亡。胱天蛋白酶(caspase)在細胞凋亡過程中起著關鍵作用,其在細胞內以非活性前體酶原的形式存在。凋亡啟動后,線粒體膜間隙的細胞色素c穿過線粒體膜到達胞質,與dATP和凋亡蛋白酶激活因子1(apoptosis protease-activating factor-1,Apaf1)形成凋亡體,凋亡體募集pro-caspase-9并將其激活,活化的caspase-9通過自身的caspase級聯反應激活caspase-3和caspase-7,進而使蛋白質水解,導致細胞凋亡。此外,細胞外的損害因子(如TNF-α等)可與細胞膜表面受體結合并募集胞內的Mort1(一種死亡域蛋白)形成復合體,激活caspase-8,進而激活caspase-3,引起細胞凋亡[3]。研究表明,海藻糖可以通過上調HSP27和HSP70抑制細胞色素c的釋放,并降低caspase-3的表達,從而起到保護脊髓的作用,使其免受損傷[42]。在線粒體外,HSP70與Apaf1結合,從而阻止pro-caspase-9募集到凋亡小體[15]。此外,HSP70還可以通過結合腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體1和2(TNF-related apoptosis inducing ligand-receptor 1/2,TRAIL-R1/2)來阻止細胞凋亡[43]。Bcl-2家族蛋白中的Bcl-2是細胞凋亡的負調控因子,它可以阻斷細胞色素c和凋亡誘導因子在線粒體的釋放。在神經元缺血的模型中,HSP70可通過增加Bcl-2的水平抑制凋亡[44]。Chang等[45]通過運動預處理SCI大鼠發現,受損的脊髓灰質中神經元和星形膠質細胞可以通過過表達HSP72來抑制凋亡,促進SCI大鼠神經功能恢復。

2.2.5 抗氧化應激作用

如前所述,脊髓損傷后神經元和膠質細胞線粒體功能的喪失,以及小膠質細胞和中性粒細胞的激活,使得ROS產生增加。而ROS的積累能夠分解蛋白質、過氧化脂質和損傷DNA,進而誘發神經元凋亡[46]。相關研究表明,HSP70能夠促進抗氧化劑過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽等的表達。在膠質細胞中,HSP70的過表達可以使細胞免受葡萄糖剝奪和H2O2的損傷,這與谷胱甘肽的產生增加有關[47]。Wang等[48]研究發現,采用低頻脈沖電磁場治療SCI大鼠時可以上調HSP70的表達,并能增加過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的產生,降低誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)和ROS的水平。此外,HSP70可以阻止ROS誘發的DNA碎片化,保護細胞使其免受H2O2誘導的氧化應激[5]。因此,脊髓損傷后HSPs表達增加可以通過促進抗氧化劑蛋白質的產生和阻止DNA碎片化等來提高脊髓神經元的抗氧化應激能力。

2.3 熱休克蛋白治療脊髓損傷的研究現狀

近年來,國內外學者在通過誘導HSPs產生來治療SCI方面進行了大量研究。如上所述,Huan等[41]發現,寶珍丸可以通過誘導HSP27的表達來抑制脊髓損傷后的炎癥反應。Nasouti等[42]研究表明,海藻糖可以通過上調HSP27和HSP70的表達抑制神經元凋亡。Chang等[45]通過運動預處理SCI大鼠發現,過表達HSP72能夠抑制星形膠質細胞和神經元凋亡。此外,Tanabe等[49]發現,苦參堿可以直接激活細胞外HSP90,進而促進急性SCI小鼠軸突的生長和功能恢復。Huang等[50]研究表明,高壓氧治療可以促進HSP32的表達,進而增加大鼠原代脊髓神經元抵抗氧化或糖氧剝奪損傷的能力。總的來講,雖然HSPs在SCI治療方面的研究已經取得了一些進展,但由于HSPs保護機制的多樣性和SCI疾病的復雜性,當前誘導HSPs產生的機制并不是十分清楚。因此,探索HSPs產生及作用的深層機制,并研發HSPs誘導效率高、毒副作用小、經濟成本低的藥物將是今后研究的重要方向。

3 展望

綜上所述,HSPs與脊髓損傷后神經功能的恢復密切相關。脊髓損傷后,HSPs作為保護性分子表達增高,發揮分子伴侶、促進血管生成、抑制炎癥反應、抑制細胞凋亡、抗氧化應激等作用,從而減緩脊髓損傷的進一步加重,這為基于HSPs治療SCI提供了一條新的思路。現階段,如何誘導脊髓損傷后HSPs的表達,進而促進神經功能的恢復是SCI領域的研究熱點之一。雖然有關藥物、運動、高壓氧等誘導HSPs表達的研究已有一定的進展,但仍未有臨床應用的報道。因此,探索促進HSPs表達的機制及其對SCI的保護機理仍是今后研究的重點。