外泌體及其miRNA在神經系統常見疾病診斷和治療中的研究進展

李 武,牛曉晨,張 萌,程 葉,盧 英,田 甜,杜 姍,米 顏,史文珍,2*,田 曄,*

(1．西北大學生命科學學院,中國陜西西安710069;2．西北大學附屬醫院/西安市第三醫院醫學研究中心,中國陜西西安710016;3．延安大學醫學院,中國陜西延安716000)

外泌體(exosome)是1983年Pan和Johnstone在體外研究綿羊網織紅細胞轉化為成熟紅細胞的過程中首次發現的,其中攜帶多種信息分子[1]。隨著社會老齡化問題日益嚴重,神經系統疾病發病率逐年上升,其中包括缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS)、阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)等在內的多發病、常見病已經成為危害老年人健康的主要“殺手”之一[2～4]。近年來,外泌體成為生物醫學的研究熱點,主要包括其在多種疾病發生和發展中的作用機制。本文著重對外泌體在上述3種神經系統常見疾病診斷和治療中的研究進展進行了總結,希望為其在臨床診斷和治療方面提供思路。

1 外泌體的概述

外泌體主要來源于細胞內的多囊泡內體或多泡體,經過多囊泡內體外膜與細胞膜融合分泌到胞外間隙,直徑為30～100 nm[5]。2005年,Caby等[6]首先在人的外周血中發現外泌體。現有研究顯示,外泌體在人的唾液、尿液、乳汁、腹水以及腦脊液(cerebro-spinal fluid,CSF)等多種體液中也廣泛存在[7]。研究表明,外泌體能夠作為在細胞間進行信息傳遞的載體,其中所攜帶的內容物主要包含mRNA、miRNA、DNA片段和蛋白質等多種生物活性物質[8～9]。外泌體可以通過精密的分選機制以及運送方式將內容物遞送到特定的受體細胞,從而改變受體細胞的生理狀態[10～11]。在某些疾病的發生和發展過程中,外泌體中所含的內容物如mi-RNA、蛋白質等會發生改變,提示外泌體可以作為潛在的生物標志物[12]。此外,外泌體也參與血管生成、免疫應答和炎癥反應等多種生理過程,并且能充當靶向藥物遞送載體來發揮疾病治療作用[13]。

2 外泌體的分離和鑒定

由于在提取外泌體的過程中會混雜其他種類的胞外囊泡,它們在直徑、形態以及生化特性等方面具有很大的差異,而獲得高純度的外泌體是后續實驗的前提和基礎,因此有效地進行分離和鑒定對于外泌體的研究至關重要。目前,分離外泌體最常用的方法是超速離心法和試劑盒法。超速離心法與密度梯度離心法相結合可以得到純度更高的外泌體。試劑盒法與超速離心法相比,操作簡單、快速高效,但存在純度不足的缺點。此外,外泌體的分離還有過濾、超濾、凝膠色譜和免疫磁珠法等諸多手段[14～15]。

外泌體的鑒定主要包括粒子直徑、形態結構以及標記蛋白3個方面。納米粒子跟蹤分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)用來測定粒徑是否符合外泌體的定義;電鏡可以觀察外泌體的經典結構;蛋白質印跡法(Western-blot,WB)可用來對外泌體膜上特異性表達的標記蛋白(CD63、CD81、TSG101 等)進行檢測[16～17]。目前外泌體的分離純化手段很難獲得十分純凈且單一的外泌體樣品,因此以上3種方法相結合可作為一種高質量的外泌體鑒定手段。

3 外泌體在神經系統常見疾病診斷中的作用

3.1 外泌體對IS的診斷作用

腦卒中是世界范圍內致死和致殘的主要原因[18～19],是一種發病機制復雜的腦血管疾病。腦卒中分為缺血性卒中和出血性卒中,其中IS占70%以上[20]。大量研究表明當發生IS時,外泌體中多種miRNA的表達水平會發生變化,因此證明外泌體miRNA與IS的診斷之間可能存在關聯。Chen等[21]在72 h內采集50例急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke,AIS)患者的血樣進行分析后發現,與對照組相比,AIS患者中外泌體miR-223顯著上調,并且與國立衛生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale,NIHSS)評分呈正相關。同時,預后不良患者中外泌體miR-223的表達高于預后良好的患者。這就說明外泌體miR-223的表達與AIS的嚴重程度相關,可以作為診斷IS的潛在生物標志物。Li等[22]發現,與對照組相比,亞急性期(subacute ischemic stroke,SIS)組血漿外泌體miR-422a和miR-125b-2-3p的表達水平顯著降低,同時AIS組血漿外泌體miR-422a的水平升高。此外,SIS組血漿外泌體miR-422a和miR-125b-2-3p的表達水平顯著低于AIS組。因此,血漿外泌體miR-422a和miR-125b-2-3p有望成為監測和診斷IS以及區分IS階段的生物標志物。Zhou等[23]收集了來自AIS患者和健康人群的血液樣品,通過定量逆轉錄聚合酶鏈反應(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)分析發現,與健康人群相比,卒中后24 h內的AIS患者的外泌體miR-134顯著增加,并且與NIHSS評分、腦梗死體積呈顯著正相關。這意味著外泌體miR-134有可能成為IS診斷和預后的潛在生物標志物。綜上可見,外泌體miRNA有望成為IS診斷和預后相關的可靠的生物標志物;檢測外泌體miRNA不僅能夠為IS的臨床診斷、病情評估提供有效的信息,還可以在早期對疾病的發生進行預測。

3.2 外泌體對AD的診斷作用

AD是一種神經退行性疾病,大多數患者在早期可能沒有臨床癥狀。以往臨床上應用最廣泛的是1984年由美國國立神經語言障礙卒中研究所和阿爾茨海默病及相關疾病學會所制定的標準,但是傳統的標準不能對AD進行早期診斷,缺乏特異性和敏感性,并且存在對“可疑(possible)”AD的過度診斷。隨著人們對AD生物學基礎的不斷認識,新修訂的標準增加了影像學和實驗室診斷。其中,實驗室診斷主要依靠CSF中Aβ42、T-tau和P-T181-tau的濃度變化。最近研究發現,AD患者外周血神經元衍生的外泌體中Aβ42、T-tau和P-T181-tau的水平均高于對照組,并且與CSF中的 Aβ42、T-tau 和 P-T181-tau 具有一致性[24]。上述結果證實外泌體中的 Aβ42、T-tau和 PT181-tau也具有相同的診斷AD的能力。

此外,外泌體中的多種miRNA也可以被視為診斷AD的潛在生物標志物。Yang等[25]通過qRT-PCR對AD患者的外周血進行分析后發現,與對照組相比,AD組中外周血外泌體miR-135a和miR-384的水平均上調,而miR-193b的水平下調。之后有學者從分離于早發性AD(youngonset Alzheimer’s disease,YOAD)患者腦脊液的外泌體miRNA表達譜中發現,miR-16-5p、miR-125b-5p、miR-451a和miR-605-5p與對照組相比呈現出差異表達。在另一組遲發性AD(late-onset Alzheimer’s disease,LOAD)患者中,miR-125b-5p、miR-451a和miR-605-5p也具有類似的差異表達,但miR-16-5p與對照組相比無差異表達[26]。由此可見,外周血和腦脊液中的外泌體miRNA有望成為診斷AD的潛在生物標志物。因此,外泌體中包含的Aβ、T-tau以及miRNA在AD的發生、發展過程中扮演著重要角色,檢測外泌體中Aβ、T-tau以及miRNA的表達水平對于AD臨床診斷、預后評估具有重要的參考價值。

3.3 外泌體對PD的診斷作用

PD是一種常見于中老年的神經系統病變疾病,臨床上以靜止性震顫、運動遲緩肌強直和姿勢平衡障礙為主要特征[27]。其進展緩慢且發病機制尚未完全清楚,早期臨床癥狀不明顯。隨著PD研究的不斷深入,臨床上也將腦脊液中α-突觸核蛋白(alpha-synuclein,α-Syn)的含量改變作為輔助診斷PD的手段之一。有研究發現,與對照組相比,α-Syn在PD患者CSF中的含量較低,而在患者血漿外泌體中的含量更高,并且血漿中外泌體α-Syn的含量與PD的嚴重程度存在顯著相關性。該結果表明外泌體α-Syn有助于診斷PD[28]。

近年來的研究發現,CSF和外周血中的外泌體miRNA具有成為診斷PD生物標志物的潛在價值。2015年,Gui等[29]發現,與健康對照組相比,PD患者CSF外泌體中miR-1和miR-19b-3p的表達下調,而miR-153、miR-409-3p和miR-10a-5p的表達上調。相關研究也報道,外周血外泌體中 miR-185、miR-15b、miR-221、miR-181a、miR-331-5p以及miR-505的含量在PD患者中均存在顯著變化[30～31]。這些表明CSF和外周血中的外泌體miRNA在PD的診斷方面具有潛在價值。如上所述,外泌體中的α-Syn和miRNA與PD的嚴重程度具有顯著相關性,可能成為評估臨床PD患者病情發展的有效生物標志物。

4 外泌體在神經系統常見疾病治療中的作用

4.1 外泌體對IS的治療作用

間充質干細胞(mesenchymal stem cell,MSC)是一種可分化成多種特異性細胞的多能干細胞,在骨髓、胎盤、臍血和脂肪組織中均可得到[32]。其衍生的外泌體在治療IS中具有應用潛力。有研究表明,從miR-133b過表達的MSC中分離出的外泌體能夠改善神經元的可塑性以及卒中后的神經功能恢復,同時刺激星形膠質細胞促進神經突起外泌體的二次釋放[33]。研究人員還發現,與對照MSC外泌體相比,轉染miR-17-92簇的MSC衍生的外泌體通過下調PTEN水平激活PI3K/Akt/mTOR信號通路,使得糖原合酶激酶3β(glycogen synthase kinase 3β,GSK-3β)的活性受到抑制,從而顯著促進神經再生[34]。

此外,其他種類細胞衍生的外泌體對卒中后腦部功能的恢復也具有積極的作用。2019年,Song等[35]在小鼠腦缺血再灌注(ischemia/reperfusion,I/R)損傷模型中發現,M2小膠質細胞衍生的外泌體中的miR-124通過下調其下游靶標泛素特異性蛋白酶14(ubiquitin-specific protease 14,USP14)的表達來減少神經細胞的凋亡,并且促進神經元的存活。近期研究發現,內皮細胞衍生的外泌體部分抑制I/R誘導的SH-SY5Y神經細胞的凋亡,從而使其免受I/R損傷[36]。另有研究報道,姜黃素負載的小鼠胚胎干細胞(embryonic stem cell,ES cell)衍生的外泌體能夠減輕IS造成的損傷,并有助于恢復小鼠腦I/R損傷后的神經血管功能[37]。

由于大腦具有血腦屏障,這就降低了外泌體進入腦梗塞部位的效率。Yang等[38]發現,狂犬病病毒糖蛋白(rabies viral glycoprotein,RVG)修飾的外泌體可以穿過血腦屏障,并有效地將miR-124轉移到腦梗塞部位。因此,RVG-外泌體作為遞送載體在IS的臨床治療中具有潛在的作用。

綜上可知,外泌體可能成為IS的新治療方案,并在臨床治療方面擁有巨大的發展潛力。

4.2 外泌體對AD的治療作用

AD的病理機制主要是由于大腦神經中β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein,Aβ)沉積形成斑塊,對神經突觸造成損傷,從而使記憶力和認知能力喪失[39]。2014年,Yuyama等[40]發現神經母細胞瘤衍生的外泌體表面富含一種鞘糖脂(glycosphingolipid,GSL),其對Aβ在體外和體內的結合以及在外泌體上的組裝是必不可少的;通過將攜帶GSL的外泌體注射到Aβ大鼠腦中,能夠降低Aβ水平,從而減輕淀粉樣蛋白的沉積。隨后,相關研究發現,與對照組相比,脂肪干細胞(adipose-derived stem cell,ADSC)衍生的外泌體能夠使AD小鼠來源的神經干細胞中的Aβ42水平、Aβ40水平以及Aβ42/40比值下降。該研究還進一步發現ADSC衍生的外泌體能夠降低AD小鼠來源的神經干細胞的凋亡,增強大腦中被Aβ損傷的神經突觸的生長,從而改善神經功能[41]。腦啡肽酶(neprilysin,NEP)是一種重要的降解Aβ沉積的酶。Katsuda等[42]發現人ADSC衍生的外泌體可分泌NEP,將攜帶有NEP的外泌體轉移到小鼠來源的神經瘤母細胞中,能夠部分降解其中的Aβ,從而降低淀粉樣斑塊的形成。這些研究都提示外泌體可以通過減少Aβ沉積來改善AD,有望成為AD潛在的治療來源。總的來講,外泌體在治療AD方面具有一定的應用前景。

4.3 外泌體對PD的治療作用

PD顯著的病理學改變包括:中腦黑質多巴胺能神經元變性死亡;紋狀體多巴胺含量顯著性減少;以及黑質殘存神經元胞質內出現嗜酸性包涵體,也稱路易小體(Lewy bodies)[43]。有研究發現,源自人類脫落乳牙的牙髓的干細胞(stem cell derived from the dental pulp of human exfoliated deciduous teeth,SHED)衍生的外泌體能夠抑制6-羥基多巴胺(6-hydroxy-dopamine,6-OHDA)誘導的多巴胺能神經元凋亡,從而對神經起到保護作用,這提示SHED衍生的外泌體可能具有治療PD的潛力[44]。2018年,相關研究報道,血液外泌體能夠穿過血腦屏障成功地將多巴胺遞送至大腦中的紋狀體和黑質,使得多巴胺在大腦中的濃度增加;在PD小鼠模型中,相比于靜脈內注射多巴胺,外泌體負載的治療效果更優,并且毒性也更低[45]。隨后,Ren等[46]發現了能夠特異性識別α-Syn的DNA適配體。在小鼠PD模型中,通過RVG修飾的外泌體可將適配體有效地遞送到腦中,從而顯著減少病理性α-Syn聚集體和神經元凋亡,并且還可以改善運動障礙。以上信息提示,外泌體有希望成為靶向治療PD的藥物遞送載體。總的來講,外泌體在PD的治療方面具有潛在價值,有望成為新的研究熱點。

5 展望

外泌體作為一種包含多種生物信息分子的囊泡,在生物體內發揮著重要的生物學功能。近年來許多研究發現,外泌體在心血管疾病(如心肌梗死)、自身免疫疾病(如類風濕性關節炎)以及腫瘤等多種疾病的發生和發展過程中扮演著重要角色[47～49],其在神經系統常見疾病的診斷和治療方面也具有廣闊空間。目前,雖然外泌體在神經系統常見疾病的診斷和治療中已經展開廣泛研究,但仍然存在一些問題:1)外泌體中RNA的研究主要集中在miRNA,有關其他的特異性RNA如長鏈非編碼 RNA(long non-coding RNA,lncRNA)、環狀RNA(circular RNA,circRNA)等的研究較少,存在一定的局限性;2)外泌體作為一種新型載體,如何將“藥物”有效地加載到其中以及其在動物體內的生物安全性如何還不太明確;3)臨床應用中缺乏足夠多的樣本數量和臨床數據,外泌體在這些疾病的診斷和治療中的研究仍處于理論與實驗階段;4)外泌體中所攜帶的多種生物活性物質在此類疾病中的作用機制尚未完全清楚。雖然研究過程中存在諸多局限和挑戰,但是隨著該研究領域的不斷深入,越來越多新的研究方法和技術將被開發運用,這將大大推動外泌體的研究,從而使其在疾病的診斷和治療中發揮更大更具價值的作用。