卵巢早衰的細胞凋亡機制及針灸干預研究進展

蔡靚，李麗，趙以琳，宗道寬，劉希茹，童國慶

(上海中醫藥大學附屬曙光醫院生殖醫學中心，上海 201203)

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)被定義為40歲之前卵巢功能出現衰竭的狀態，閉經時間≥4～6個月或兩次月經間隔4周以上，FSH>40 U/L，伴有雌激素降低及絕經癥狀。隨著社會經濟的飛速發展，女性生育年齡的推后，以及環境與疾病的各種影響，POF的發病率逐年升高[1]。誘發卵巢衰老的原因包括遺傳、DNA損傷修復、端粒、能量代謝、神經內分泌、卵巢微環境等因素[2]。但大多數POF患者仍無法找到具體原因，即不明原因POF。在POF早期發生的卵泡閉鎖過程中，卵母細胞首先發生凋亡，卵泡顆粒細胞由內層向外層逐漸凋亡；而生長晚期的卵泡，顆粒細胞首先凋亡，誘導卵母細胞凋亡，觸發了卵泡閉鎖。因此不論何種原因導致的POF，卵巢中卵母細胞與顆粒細胞的凋亡都是POF發病的重要因素。目前激素替代療法(hormone replacement therapy，HRT)是最基本的治療方法之一。但最近一些研究表明，接受HRT治療也會伴隨不良作用[3]。近年來，祖國醫學應用于此類疾病的治療案例屢見不鮮，針灸在治療婦科疾病如子宮肌瘤、多囊卵巢綜合征(PCOS)等中成功的例子也多有報道。因此本文中，我們探討了POF發生發展中細胞凋亡的作用機制以及針灸干預治療POF的潛在效應。

一、細胞凋亡誘導POF的發病機制

POF的發生與細胞凋亡有密切關系。卵母細胞的成熟依靠卵巢和卵泡微環境自身穩態的維持。顆粒細胞產生多種物質支持卵母細胞的生長成熟，卵母細胞也分泌多種細胞因子作用于顆粒細胞表面上相應的受體，促進顆粒細胞的增殖和分化，卵母細胞和顆粒細胞間在卵泡發育的不同階段都存在著聯系[4]。二者之間的共同作用參與調節卵泡成熟及排卵的過程，該過程涉及到多種信號通路，如cAMP、PI3K/AKT、mTOR、MAPK、Beclin-1/Bcl-2等[5]。顆粒細胞的凋亡也會導致卵母細胞凋亡。卵母細胞與顆粒細胞的凋亡共同促進卵泡閉鎖加速，從而導致POF。但是基于卵巢特有的生理環境和卵泡發育過程，其凋亡的發生又有著特殊的調控因素和模式[6]。

近年來有研究提示氧化應激可能在POF的發生發展中具有重要作用。Yu等[7]的研究顯示，亞砷酸鈉可通過氧化應激和對類固醇代謝的影響引起卵母細胞凋亡，從而進一步導致大鼠卵泡的閉鎖。Tokmak等[8]研究發現POF患者血清中的誘導型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)和總抗氧化狀態(total antioxidant status，TOS)水平高于健康的育齡女性，均提示氧化應激參與了POF過程。

二、卵巢顆粒細胞凋亡的內在機制

卵泡顆粒細胞的增殖和分化是卵泡發育成熟的基本條件，顆粒細胞為卵母細胞供給生長發育所需的大部分營養，顆粒細胞的狀態對卵母細胞質量及胚胎發育潛能有很大影響，其凋亡異常直接導致卵泡發育異常[9]。顆粒細胞凋亡是卵泡閉鎖的重要因素之一[10]，正常情況下顆粒細胞分裂增殖和凋亡共同存在，當顆粒細胞凋亡率達到一定程度時卵泡閉鎖發生。而一定數量的卵泡同時發生閉鎖，就會導致POF。與普通細胞一樣，顆粒細胞的凋亡也是細胞程序性死亡，具有凋亡的形態學特征和分子生物學變化：從接受凋亡信號到凋亡調控分子間相互作用再到蛋白水解酶caspase活化，最后進入連續反應過程。有研究報道卵泡顆粒細胞凋亡與Fas/FADD信號通路及B細胞淋巴瘤/白血病-2基因(Bcl-2)的表達密切相關[11]。

1.顆粒細胞凋亡的線粒體途徑：線粒體途徑，又稱內源性途徑，指當細胞受到各種因素影響時，如細胞缺氧、癌基因被激活、DNA損傷、氧化應激反應的發生等，會改變線粒體膜的通透性，使促凋亡因子[如細胞色素C(cytochrome C，Cyt C)]穿透線粒體膜，激發細胞凋亡級聯反應[12]。

Bcl-2家族對卵巢顆粒細胞凋亡起決定作用，Bcl-2家族蛋白存在于免疫、神經、內分泌系統等正常組織中，亦存在于人卵巢組織中，位于線粒體外膜、內質網膜和核膜上。研究顯示Bcl-2家族通過線粒體途徑調控顆粒細胞的凋亡：(1)作用于抗凋亡蛋白，如Bcl-2等：通過抑制促凋亡蛋白Bax的線粒體膜透化作用來阻礙細胞凋亡，若抗凋亡蛋白的表達被抑制，則會促進顆粒細胞凋亡[13]；(2)作用于促凋亡蛋白，如Bax和Bak：在細胞受到凋亡刺激因子作用后被激活，結合到線粒體外膜并在線粒體外膜上形成25～100 nm的圓形孔道[14]，促使Cyt C和其他促凋亡因子穿透線粒體膜進入胞質，誘發凋亡；(3)作用于BH3-only蛋白：此類蛋白能夠直接激活Bax或Bak，導致細胞凋亡[15]。

2.顆粒細胞凋亡的死亡受體途徑：細胞凋亡的外源性信號通路是通過死亡受體介導的，死亡受體屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族，其胞漿區有一個具有蛋白水解功能的同源氨基酸殘基結構，稱為“死亡區域”(deathdomain，DD)。其介導的信號轉導途徑主要有3條，分別為TNFR、TRAIL和Fas/FasL信號途徑。以Fas/FasL信號途徑為例，FasL和Fas結合激活的受體與FADD結合，形成死亡誘導信號復合體(death inducing signalling complex，DISC)，從而激活下游的Caspase分子，誘發細胞凋亡的發生[16]。另一方面Fas激活的Caspase-8會進一步激活Bcl-2家族成員，致使線粒體外膜透化(mitochondrial outer membrane permeabilization，MOMP)的發生，線粒體釋放Cyt C，引發下一步級聯反應[17]。

Fas配體(Fas ligand，Fas-L)和Fas，兩者均表達于顆粒細胞，是死亡受體途徑中最常見的引起顆粒細胞凋亡的蛋白。林鵬飛等[18]檢測顆粒細胞中Fas-FasL mRNA的表達，發現Fas、Fas-L mRNA的表達隨細胞培養時間的延長而增高，由此可推測Fas/Fas-L通路的激活有可能是引發顆粒細胞凋亡的重要因素之一。

3.細胞凋亡的內質網途徑與ROS蛋白：內質網途徑(endoplasmic reticulum signaling，ERS)主要是內質網應激導致Ca2+超載或者穩態失衡，可以有兩種途徑誘發凋亡，一是直接激活Caspase分子，二是激活Bax和Bak，誘發線粒體凋亡的級聯反應，這也可以看作是凋亡內源性途徑的補充。目前研究發現，由內質網應激導致細胞凋亡的途徑有2條，一是CHOP(C/EBP homologous protein)凋亡途徑，二是Ire1-JNK(c-Jun N-terminal kinase)凋亡途徑[19]?；钚匝醴肿?reactive oxygen species，ROS)和Ca2+的相互作用對凋亡發生與發展有重要影響，ROS過多會激發內質網應激途徑的細胞凋亡[20]，細胞內的多種結構都含有豐富的Ca2+，內質網應激發生時，內質網會釋放Ca2+，從而線粒體內Ca2+也會增加，誘導線粒體產生ROS，導致線粒體功能障礙，最后導致凋亡。

ROS是氧化應激誘導細胞凋亡的重要因素，機體在正常情況下會產生少量ROS，ROS的產生和機體的抗氧化能力之間的平衡打破時，引起卵泡閉鎖，最終導致POF。

4.誘導顆粒細胞凋亡的其他相關蛋白：還有一些其他蛋白參與顆粒細胞的凋亡，比如NF-kB、FOXO3(forkhead box O3)、髓細胞瘤病毒癌基因(myelocytomatosis viral oncogene，Myc)和p53。研究發現，NF-kB能夠調控細胞的調亡，NF-kB能上調凋亡基因Fas、c-myc及TNF-α的表達，引起細胞凋亡[21]。FOXO3是FOXO的轉錄因子，上調FOXO3的表達能夠誘發顆粒細胞凋亡，促進卵泡的閉鎖。研究顯示，Myc蛋白可能具有促進顆粒細胞凋亡的作用，進而誘導卵泡膜細胞的凋亡[22]。Liang等[23]研究指出，p53促進顆粒細胞凋亡的機制可能是p53抑制顆粒細胞內由轉化生長因子-β1(TGF-β1)誘導的有關pri-miRNA的表達，繼而通過pri-miRNA影響卵巢顆粒細胞的生長、發展和凋亡的過程。p53的一個同系物TAp63作為DNA損傷凋亡通路的關鍵調控因子，與磷酸化的c-Abl(一種原癌基因)相互作用，級聯激活Bax和Bak，誘發顆粒細胞凋亡級聯反應。

三、卵巢卵母細胞凋亡的內在機制

1.卵母細胞凋亡的途徑：卵母細胞的凋亡主要是通過線粒體途徑及死亡受體途徑，其過程與發生在顆粒細胞中的凋亡類似。Bcl-2家族在卵母細胞的生長發育過程中發揮著重要作用。有研究表明抗凋亡因子Bcl2-L10在卵母細胞中具有特異性表達，對卵母細胞的發育、成熟及受精都有重要影響，對于卵母細胞的減數分裂過程有關鍵作用[24]。在衰老的卵母細胞中，促凋亡因子Bax通過中和Bcl2-L10加速卵母細胞凋亡進程，Bax表達的升高激活后續caspase級聯凋亡反應，卵母細胞出現凋亡相關的生化和形態學改變[25]。

卵母細胞凋亡的死亡受體信號通路主要由腫瘤壞死因子受體家族FAS和TNFR1介導，與它們的配體(Fasl和TNFa)結合后被激活。研究表明大鼠卵母細胞中，磷酸化Thr161 Cdk1(cyclin-dependent kinase 1)水平的降低，推動Fasl介導的卵母細胞凋亡，激活一系列后續級聯反應，最終激活caspase-3導致卵母細胞凋亡[26]。活化的caspase-3切割關鍵結構及調節相關蛋白，導致DNA被破壞，這些被破壞的DNA片段能夠在凋亡的卵母細胞中被檢測到[27]。

2.ROS對卵母細胞凋亡的影響：ROS的產生或抗氧化系統的缺失也易導致卵母細胞的凋亡。ROS可導致線粒體膜電位的下降及線粒體通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore，mtPTP)的開放，使Cyt C從轉換孔中釋放，與凋亡激活因子-1(apoptosis activating factor-1，Apaf-1)結合，活化caspase-9，激活下游的效應caspase，啟動細胞凋亡。研究表明，Bcl-2蛋白家族中促凋亡蛋白，如Bcl-2、Bcl-XL，能夠促進mtPTP的開放，激活卵母細胞凋亡級聯反應[28]。研究發現，Ca2+載體(Ca2+ionophore，CI)通過增加細胞內Ca2+水平誘導ROS產生而導致小鼠卵母細胞的凋亡，cAMP和cGMP水平的降低也可增加Ca2+水平而誘導ROS產生[29]。ROS持續產生可導致氧化應激，氧化應激降低了雙線期和MⅡ阻滯期卵母細胞內的存活因子和成熟促進因子(maturation-promoting factor，MPF)的不穩定性，持續降低MPF的不穩定水平可激發卵母細胞的凋亡[30]。

四、針灸干預POF的作用機制

近年來有研究表明，針灸具有抗氧化、調節自由基代謝，調節內分泌、抗衰老、抑制細胞凋亡、改善卵巢與子宮微環境、促進卵泡成熟等多種改善POF癥狀、延緩POF進程的作用[31]。有研究探討了針灸抑制卵巢細胞凋亡的機制，選取符合圍絕經期特征的雌性大鼠為對象，采用針刺大鼠腎俞、足三里、三陰交穴位治療，與未接受針刺的大鼠對比發現，針刺治療后圍絕經期大鼠卵巢顆粒細胞 Fas mRNA表達明顯降低，而Bcl-2 mRNA表達明顯提高[32]。鄭艷華等[33]也發現低頻電針能夠降低大鼠卵巢組織中Bax的蛋白表達，下調Bax/Bcl-2比值；卵巢染色切片發現，接受針刺的大鼠卵巢可見多個黃體存在，囊性卵泡減少，顆粒細胞層明顯增厚。可以推測，針灸可能是通過線粒體途徑和死亡受體途徑抑制卵巢細胞凋亡，改善卵巢微環境，從而延緩POF的進程。

PI3K/Akt通路通過抑制細胞的凋亡，增加細胞的存活率，在減輕氧化應激損傷中發揮著重要的作用；當PI3K/Akt通路遭到影響，會增加氧化應激的發生，抑制細胞增殖，進一步激發凋亡級聯反應[34]。有研究以環磷酰胺腹腔注射SD雌性大鼠建造POF動物模型，將造模成功的大鼠分組后針刺干預，發現針刺組成熟卵泡數量增加，血清E2水平提高，FSH下降明顯，相關信號通路的PI3K、Akt和mTOR mRNA的表達量呈升高趨勢，表明針刺對于POF的治療具有一定效果；其作用機制可能與上調PI3K/Akt通路的相關基因有關[35]。

p53在卵巢顆粒細胞凋亡中也起了重要作用。許多凋亡因子基因啟動子可與p53結合，激活后續級聯反應，促使凋亡相關因子Fas、FasL、促凋亡蛋白Bax等表達增高，誘導細胞凋亡。相珊等[36]研究發現，電針治療可以提高行IVF-ET的不孕癥女性獲胚數及優質胚胎率，并且可以下調其卵巢顆粒細胞中p53 mRNA、Bad mRNA的表達。由此推測電針治療可以通過下調p53及Bad的過表達達到抑制卵巢顆粒細胞凋亡、保護卵巢功能的效果。

鄭艷華等[37]發現低頻電針能夠降低大鼠血清性激素結合球蛋白(sex hormone-binding globulin，SHBG)、β細胞功能指數(modified βcell function index，MBCI)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及血糖水平，其機制可能是通過調節胰島β細胞的功能，減少氧化應激反應的發生。有研究報道房繄恭教授的“調經促孕針法”在促進排卵及恢復卵巢功能的治療上，也取得了很好的臨床療效，其機制在于“調經促孕針法”能夠下調血清FSH、LH水平，從而達到改善POF的效果[38]。針灸可以通過減輕氧化應激改善卵巢與子宮的功能，延緩卵巢與子宮的衰老進程，可能是針灸治療POF的機制之一。

五、結語

綜上，HRT的治療方案雖仍是目前治療POF的經典方法之一，但激素潛在的致癌作用、影響肝腎代謝、增加血栓等風險限制了其長時間應用[39]。治療后一旦停止用藥，病情就容易反復，這些問題增加了POF患者的心理負擔，降低了依從性，使治療難以堅持，也限制了其長期應用?，F有多個研究證明針灸治療能調節人體內分泌及代謝水平，明顯減少卵巢中發生的氧化應激反應，降低卵巢顆粒細胞及卵母細胞的凋亡；并通過延緩細胞的凋亡，來調節卵巢顆粒細胞的分泌功能，調控卵泡的發育，延緩卵巢衰老，降低POF的發生率。本文中，簡要介紹了針灸干預POF細胞凋亡途徑的作用機制。傳統中醫手段干預POF的發生發展，吸引了越來越多的關注，但這些治療方法仍缺乏高質量控制的臨床試驗評估以及深入的機制研究。如果將針灸與HRT聯合應用，可能會提高POF的治療效果，降低HRT療法的不良反應，也許是綜合醫學的又一突破。鑒于POF女性對于HRT和自然療法的需求，有必要進一步研究針灸的作用機制，也需要更多證據來支持傳統中醫療法在POF治療中的應用。