氣體信號分子對心血管系統線粒體的作用

顧依靜,武 丹,祝德秋

(同濟大學附屬同濟醫院藥劑科,中國上海200065)

氣體信號分子(gasotransmitter,gaseous signal molecule)是一類能夠自由穿透細胞膜、具有特定生理學功能和作用靶點、由酶促反應生成、受體內代謝途徑調控的內源性氣體分子[1]。1987年,研究證實一氧化氮(nitric oxide,NO)是一種具有舒張血管效應、由血管內皮細胞釋放的信使分子[2]。隨后相繼有研究報道,在哺乳動物體內存在內源性一氧化碳(carbon monoxide,CO)[3]和硫化氫(hydrogen sulfide,H2S)[4]。內源性CO由血紅素通過酶促反應代謝生成,而內源性H2S通過催化含硫氨基酸反應生成。氣體信號分子具有抗炎[5]、抗氧化[6]、抑制細胞凋亡[7]、舒張血管[8]、保護心臟[9]等作用。心血管系統(cardiovascular system,CVS)疾病具有較高的發病率和致死率[10]。心臟作為為血液流動提供動力的重要器官,需要消耗大量腺苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP),這些能量由心肌細胞線粒體的氧化磷酸化提供。因此,線粒體在維持心肌細胞正常生理功能中發揮著重要作用,其功能紊亂會導致多種CVS疾病的發生[11～14]。氣體信號分子可對線粒體的呼吸作用、線粒體的融合與分裂、線粒體自噬,以及活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成等方面進行調控,從而介導線粒體功能,使心肌細胞維持正常的生理功能。本文主要介紹3種氣體信號分子對CVS線粒體的調節。

1 氣體信號分子的生物合成與代謝

1.1 NO的生物合成與代謝

在生物體內,一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS)以左旋精氨酸為底物,通過酶促反應生成NO和瓜氨酸。NOS可分為鈣依賴性NOS和非鈣依賴性NOS。鈣依賴性的神經元型NOS(neuronal NO synthase,nNOS)和內皮型NOS(endothelial NO synthase,eNOS)受鈣離子-鈣調節蛋白調控。在CVS中,心肌細胞、內皮細胞和血管平滑肌細胞內都有鈣依賴性NOS表達。在心臟內,eNOS主要表達于冠狀動脈和心臟內皮細胞,nNOS主要表達于心肌細胞[15]。誘導型NOS(inducible NO synthase,iNOS)屬于非鈣依賴性NOS,由感染和炎癥等機體防御反應激活[16]。大部分NO在體內經代謝生成NO2-和NO3-,只有小部分以原型隨肺呼氣排出[17]。

1.2 CO的生物合成與代謝

內源性CO由血紅素經血紅素氧合酶(heme oxygenase,HO)分解生成,同時生成副產物亞鐵離子和膽綠素。HO是一種能夠限制血紅素降解速率的酶,有3種同工酶,即HO-1、HO-2和HO-3。內源性CO主要由HO-1和HO-2催化生成。HO-1為誘導型HO,是一種分布廣泛、具有細胞保護作用的熱休克蛋白,在正常生理水平下表達較低,可被氧化應激、缺氧、高體溫、重金屬、紫外線、血紅素異常升高等外界刺激信號誘導[18]。HO-2和HO-3為結構型HO,HO-2主要表達于中樞神經系統；HO-3的活性較弱,目前尚未明確其生物學作用。CO可在細胞呼吸過程中被細胞色素c氧化酶(cytochrome c oxidase,CcOX)氧化生成二氧化碳,也可直接經肺排出體外[19]。

1.3 H2S的生物合成與代謝

在哺乳動物體內存在著3種與H2S生成相關的酶,即胱硫醚β合成酶(cystathionine β-synthase,CBS)、胱硫醚 γ 裂解酶(cystathionine γ-lyase,CSE)和3-硫基丙酸硫基轉移酶(3-mercaptopyruvate sulfurtransferase,3-MST)。CVS中的H2S由CSE和3-MST催化生成。CSE通過催化左旋半胱氨酸或同型胱氨酸生成H2S,而3-MST以半胱氨酸氨基轉移酶和半胱氨酸的代謝產物3-巰基丙酮酸為底物產生H2S。H2S的體內代謝途徑主要有以下3種:1)在線粒體硫醌氧化還原酶(sulfide quinone oxidoreductase,SQR)、S-雙加氧酶和S-轉移酶的作用下,被氧化生成S2O32-,再經氰化物硫轉移酶催化生成SO32-,最后被亞硫酸鹽氧化酶氧化成SO42-,由腎臟隨尿排出；2)在細胞質硫醇S-甲基轉移酶的作用下,生成甲硫醇和二甲硫醚；3)與高鐵血紅蛋白作用生成硫血紅蛋白[20]。

2 氣體信號分子對心血管系統線粒體的作用

線粒體是細胞進行有氧呼吸、產生ATP的場所,其通過氧化磷酸化為細胞提供能量的同時產生活性氧。在病理狀態下細胞內ROS過量產生并蓄積,使線粒體功能發生紊亂,誘導細胞死亡[21]。在CVS中,線粒體的功能異常能引起動脈粥樣硬化[11]、高血壓[12]、心力衰竭[13]、糖尿病性心肌病[14]等疾病的發生。氣體信號分子主要通過調控線粒體的呼吸作用、活性氧生成、線粒體融合與分裂、線粒體自噬來介導線粒體功能,使心肌細胞維持正常生理功能。

2.1 對線粒體呼吸作用的影響

在細胞有氧呼吸中,各電子載體在傳遞電子的過程中依次被氧化,最終生成ATP,該過程發生在線粒體內,被稱為線粒體電子傳遞鏈(electron transport chain,ETC)。ETC包括復合物Ⅰ～Ⅴ5個線粒體呼吸鏈酶復合物,以及輔酶Q和細胞色素c兩種電子傳遞體。復合物Ⅳ,即CcOX,是ETC中的最后環節。在CcOX的催化下,電子從還原型的細胞色素c傳遞至分子氧,生成水[22]。CcOX是氣體信號分子抑制線粒體呼吸作用的主要靶點,3種氣體信號分子都能夠通過CcOX途徑減少耗氧以及ATP的生成[23]。

NO與CcOX結合形成亞硝酰基衍生物(CcOX-NO)或亞硝酸鹽衍生物(CcOX-NO2-),隨后再與CcOX血紅素a2結合,從而抑制線粒體呼吸。線粒體呼吸受抑制的程度與NO、細胞色素c和O2的濃度有關[24]。在腹主動脈縮窄術(transverse abdominal aortic constriction,TAC)構建的大鼠心肌肥厚模型中,肥厚心肌細胞內iNOS上調,引起NO水平升高,CcOX活性受到抑制,加上肥厚心肌細胞線粒體對CcOX抑制的敏感性,使其更易缺乏ATP并誘發充血性心力衰竭[25]。

CO與分子氧競爭血紅素a3結合位點,抑制線粒體呼吸,減少ATP生成[26]。Wang等[27]通過對心肌細胞特異性HO-1過表達小鼠進行冠脈結扎構建了心力衰竭小鼠模型,發現心肌細胞HO-1以CO依賴方式抑制線粒體呼吸,并減少線粒體膜通透性轉換(mitochondrial permeability transition,mPT)。

高濃度的H2S與分子氧競爭結合CcOX,使線粒體內膜電勢消失,引起細胞有氧呼吸中止,從而對哺乳動物產生可逆的急性毒性；而低濃度的H2S對CcOX的抑制為非競爭性的[28]。Sun等[29]在大鼠乳鼠心肌細胞中發現,使用外源性H2S預處理能夠抑制缺氧/復氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)條件下線粒體CcOX的活性。但也有報道指出,H2S能促進線粒體呼吸,H2S對線粒體的呼吸具有雙重作用。在納摩爾到低微摩爾的水平下,H2S作為電子供體被SQR氧化,促進線粒體呼吸[30]。在高同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)血癥的大鼠模型中,線粒體呼吸受到抑制,但腹腔注射飽和H2S溶液可拮抗Hcy在CVS的生物學效應,恢復心肌細胞線粒體琥珀酸脫氫酶和CcOX活性,促進線粒體呼吸[31]。

2.2 對活性氧生成的影響

ROS由線粒體的ETC和三羧酸循環產生,是生物體內一類具有較強氧化性和生物學活性的含氧化合物,包括超氧陰離子自由基、過氧化氫(hydrogen peroxide,H2O2)、羥自由基、單線態氧等。在病理狀態下,細胞內ROS過量產生并在細胞內不斷蓄積,破壞細胞內氧化與抗氧化作用間的平衡,引起氧化應激,誘導細胞發生死亡級聯反應[32]。

氧化應激是心肌發生缺血-再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury,I/R injury)的主要原因之一。Hou等[33]合成了一種能夠在超氧陰離子自由基介導下靶向線粒體,并且原位釋放NO的新型供體MitoSNOD,同時證實MitoSNOD預處理可在體內顯著抑制I/R損傷誘導的線粒體膜電位降低,保護H9c2細胞,顯著減少Langendorf灌注的離體大鼠心臟中平均梗塞面積。

Yao等[34]證實CO釋放分子2(CO releasing molecule 2,CORM2)可改善心臟驟停后復蘇大鼠的心臟功能,減輕心肌線粒體ROS生成和氧化應激,減少線粒體及心肌細胞損傷；在體外實驗中,低濃度CORM2(20 mmol/L)對線粒體呼吸產生輕度的解偶聯作用,減少線粒體ROS生成,該效應可能由CORM2釋放的CO所介導。

我們的研究表明,H2S通過SIRT1途徑可劑量依賴性地保護H9c2細胞,使其免受H2O2誘導的氧化應激損傷,減少ROS生成,抑制H9c2細胞凋亡[35]。在生物體內,超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)是一種能夠在抵御ROS損傷中發揮重要作用的抗氧化金屬酶,包括Cu/Zn-SOD、Mn-SOD、Fe-SOD 三類。Sun等[29]在外源性H2S供體NaHS預處理的大鼠乳鼠心肌細胞中發現,H2S在抑制線粒體CcOX的同時,增加Mn-SOD和Cu/Zn-SOD的活性,從生成和清除兩種途徑對ROS進行調控,減少H/R條件下心肌細胞內ROS的水平。在血管緊張素Ⅱ誘導的肥大心肌細胞中,NaHS通過促進SIRT3的轉錄和表達減弱心肌細胞肥大,改善心肌細胞的線粒體功能,增加Foxo3a和Mn-SOD的表達,抑制心肌細胞氧化[36]。Foxo3a能夠增加抗氧化酶活性,降低細胞內ROS水平[37]。此外,過量的ROS還可使線粒體膜通透性轉換孔(mitochondrial permeability transition pore,mPTP)病理性開放,發生mPT和線粒體腫脹,繼而引起細胞死亡[38]。Karwi等[39]發現,靶向線粒體的H2S供體AP39劑量依賴性地抑制線粒體膜通透性轉換孔開放,抑制心肌細胞肌纖維膜下線粒體和肌纖維間線粒體的ROS生成,可預防和緩解I/R損傷導致的心肌梗死。

2.3 對線粒體質量控制的影響

線粒體暴露于高水平的ROS中易發生線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)突變和蛋白質折疊錯誤,導致線粒體功能障礙[40]。線粒體通過質量控制保持數目和質量穩定,從而保證線粒體和細胞的生理功能。線粒體的質量控制主要包括線粒體的生物合成、線粒體的分裂與融合以及線粒體自噬。

2.3.1 對線粒體生物合成的影響

線粒體的生物合成是從已有的線粒體中進行增殖的過程,需要核基因組與mtDNA共同參與。線粒體的生物發生能夠限制突變mtDNA的轉錄和表達,使線粒體維持正常的生命活動[41],該過程受到過氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子-1α (peroxisome proliferator-activated receptorγ coactivator-1α,PGC-1α)的調控。PGC-1α 通過刺激下游的核呼吸因子1/2(nuclear respiratory factor 1/2,NRF1/2),激活線粒體轉錄因子A(mitochondrial transcription factor A,TFAM或mTFA),促進線粒體DNA轉錄,增加線粒體的生物合成[42]。調控線粒體生物合成的另一條途徑是腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)途徑。AMPK通過激活PGC-1α增加線粒體的生物合成,同時AMPK的活性可被蛋白磷酸酶2A(protein phosphatase 2A,PP2A)抑制。

內源性H2S能夠抑制PP2A,正向調控AMPK,誘導PGC-1α信號,增加心臟線粒體的生物合成；在心力衰竭狀態下,使用外源性H2S供體SG-1002可恢復H2S水平,增加心臟線粒體含量和ATP生成,改善線粒體呼吸,從而改善心功能[43]。

Hull等[44]用多柔比星處理野生型和HO-1轉基因小鼠,誘導其心肌細胞線粒體功能發生障礙,結果顯示心臟特異性HO-1過表達可使PGC-1α、NRF1和TFAM的表達增加,同時增加線粒體DNA合成酶Polγ的表達,進而促進線粒體的生物合成。Piantadosi等[45]報道,HO-1過表達產生的內源性CO,通過誘導NRF2的基因表達與核轉運,上調NRF1的mRNA和蛋白質水平,從而激活線粒體生物合成。

研究報道,線粒體內活性氧增加,使線粒體發生損傷,活性降低,同時線粒體生物合成減弱,ATP生成減少[46]。但也有研究表明,線粒體的生物合成可通過活性氧途徑激活[47]。Suliman等[48]發現適度增加細胞CO濃度,可使線粒體通過產生H2O2、活化鳥苷酸環化酶和絲/蘇氨酸蛋白激酶Akt、誘導HO-1等途徑激活生物發生,在該過程中內源性CO和外源性CO之間具有協同作用,而且這種作用可能與血紅素的轉化率和清除率有關。

2.3.2 對線粒體融合/分裂以及自噬的影響

線粒體通過不斷的分裂與融合,使其數量保持動態平衡,維持其在細胞內的正常生理功能,該過程稱為線粒體動力學。對于衰老或受損的線粒體,線粒體可通過自噬途徑將其清除,保持細胞內線粒體質量穩定。線粒體融合蛋白1(mitofusin 1,MFN1)、線粒體融合蛋白2(mitofusin 2,MFN2)、視神經萎縮蛋白1(optic atrophy 1,OPA1)是調控線粒體融合的蛋白質,其中MFN1和MFN2位于線粒體外膜,OPA1位于線粒體內膜；而動力相關蛋白1(dynamin-related protein 1,DRP1)、線粒體分裂蛋白1(fission 1,FIS1)、線粒體裂變因子(mitochondrial fission factor,MFF)是介導線粒體分裂的蛋白質[49]。調控線粒體自噬的通路包括PTEN誘導的假定激酶1(PTEN induced putative kinase,PINK1)/E3泛素連接酶Parkin通路、BCL2和腺病毒E1B 19 kD相互作用蛋白3/Nip3樣蛋白X(BCL2 and adenovirus E1B 19 kD interacting protein 3/Nip3-like protein X,BNIP3/NIX)通路以及FUN14結構域蛋白1(FUN14 domain containing 1,FUNDC1)通路[40]。

Miller等[50]用NOS抑制劑L-NAME對SD大鼠進行處理,發現OPA1、MFN1、MFN2的表達降低,DRP1含量增加,但NOS抑制劑對線粒體自噬的影響較小,僅BNIP3略有下降,而自噬相關蛋白質Beclin1、p62的水平以及 LC3B2與LC3B1的比值均未發生顯著變化。

Hull等[44]發現在多柔比星誘導的心肌細胞線粒體功能障礙模型中,HO-1過表達會抑制線粒體中FIS1的上調,增加MFN1和MFN2的表達以及PINK1的表達,從而減少多柔比星誘導的線粒體損傷和mtDNA缺失。

Meng等[36]在TAC引起的心肌肥大小鼠模型中發現,H2S外源性供體NaHS能夠增加MFN1、MFN2和OPA1的表達,同時減少DRP1和FIS1的表達,該作用依賴于組蛋白去乙酰化酶SIRT3。Lencel等[51]在代謝綜合征小鼠模型中發現,外源性CO供體CORM3部分逆轉了高脂飲食所誘導的線粒體融合相關mRNA Mfn2和Opa1的增加,抑制了PGC-1α、NRF1和TFAM的升高,增加了自噬標記物LC3-Ⅱ,逆轉了代謝綜合征所誘導的心功能不全。在高糖誘導的H9c2細胞損傷中,MFN2表達增加,但在外源性H2S供體GYY4137給予48 h后,MFN2表達降低,H9c2細胞凋亡減少[52]。Liu等[53]在高糖高脂的大鼠主動脈內皮細胞中發現,外源性H2S可促進PINK1對Parkin的招募,通過Parkin/PINK1途徑增加線粒體自噬,促進受損線粒體的清除。

3 氣體信號分子間的相互作用

近年來,越來越多的證據表明氣體信號分子之間存在著相互作用。氣體信號分子通過影響蛋白質的翻譯后修飾,或影響另一種氣體信號分子的生物合成,產生相互協同或抑制的作用。在CVS中,氣體信號分子間的相互作用集中于NO和H2S之間,二者作用相互協同。

3.1 影響蛋白質的翻譯后修飾

氣體信號分子與蛋白質上的殘基發生可逆的共價結合,改變蛋白質的結構和功能,該過程屬于蛋白質翻譯后修飾的一種。NO對蛋白質半胱氨酸(cysteine,Cys)殘基進行修飾,將Cys上的巰基-SH轉變成-SNO的過程,稱為巰基亞硝基化(S-nitrosylation,SNO)；H2S也能對蛋白質進行類似的修飾,使-SH轉變成-SSH,稱為硫巰基化(S-sulfhydration,SSH)[54]。氣體信號分子通過介導其他氣體信號分子對蛋白質進行翻譯后修飾,從而實現對信號轉導的干預。Sun等[55]發現,在再灌注過程中給予H2S的外源性供體NaHS,能夠增加心臟保護相關蛋白質的巰基亞硝基化,顯著降低缺血后心臟收縮功能障礙和梗死面積；將NaHS與NO供體SNAP聯用能進一步增加巰基亞硝基化程度,從而獲得額外的心臟保護作用,且作用大小與-SNO的增加程度相關。Lin等[56]發現,在動脈粥樣硬化ApoE-/-小鼠模型中,H2S上調了主動脈血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)NO和蛋白質巰基亞硝基化水平,縮小了粥樣硬化斑塊面積；在用氧化低密度脂蛋白誘導的VSMC中,H2S能夠顯著逆轉iNOS表達和NO生成的減少,同時劑量依賴性地提高VSMC中蛋白質巰基亞硝基化水平,抑制VSMC的增殖和遷移。

3.2 影響氣體信號分子的生物合成

氣體信號分子還能影響彼此的生物合成。H2S可通過增加NO的生物合成,使心肌免受I/R損傷。Kondo等[57]在TAC誘導的心力衰竭小鼠中發現,H2S通過促進VEGF-Akt-eNOS-NO-cGMP信號傳導,增強了eNOS Ser1177的磷酸化修飾,緩解了線粒體呼吸功能障礙,減輕了氧化應激損傷,增加了心肌血管密度。Minamishima等[58]對心臟驟停小鼠注射H2S供體Na2S后進行心肺復蘇,結果顯示H2S通過eNOS依賴性途徑,增加了左心室和腦皮層eNOS的磷酸化,升高了血清亞硝酸鹽和硝酸鹽水平,減輕了心臟驟停引起的線粒體損傷和細胞死亡。Jin等[59]在L-NAME誘導的高血壓性心臟病大鼠中發現,外源性H2S通過激活Akt/eNOS/NO途徑,提高了血漿NO濃度和左心室組織中NOS的活性,升高了Ser1777磷酸化eNOS和Ser473磷酸化Akt的蛋白質水平,改善了LNAME引起的心臟重塑和功能障礙。

4 總結與展望

隨著對氣體信號分子在心血管系統中生物學機制的研究,人們發現內源性NO、CO和H2S通過對線粒體的呼吸作用、融合與分裂、自噬以及活性氧生成等方面進行調控,發揮抑制線粒體損傷、減輕氧化應激、促進細胞存活的作用,從而維持心肌細胞的生理功能,抑制心力衰竭、心肌肥厚、缺血-再灌注損傷、動脈粥樣硬化等病理過程的發生與發展。盡管越來越多的證據表明,在心血管系統中不同氣體信號分子之間存在著相互作用,但它們相互作用的確切機制尚未完全闡明。同時,NO和H2S進行翻譯后修飾的靶點都是蛋白質的半胱氨酸殘基,二者在修飾同一靶蛋白時的競爭機制尚不明確。此外,氣體信號分子通過翻譯后修飾改變靶蛋白活性的機制也需要進一步研究。總之,揭示氣體信號分子在心血管系統中的相互作用,有助于明確其在生理及病理過程中的作用機制,從而為心血管疾病的防治提供新的科學依據。

此外,氣體信號分子的臨床治療前景也日益得到重視,各類氣體信號分子已成為近年來的熱門研究領域。除了心血管系統外,氣體信號分子在泌尿系統、消化系統、呼吸系統等系統中也能發揮作用。由于其廣泛的生物學效應,所以在治療過程中,氣體信號分子不僅會作用于靶器官,也會影響其他系統的生理病理過程,導致脫靶效應。脫靶效應,即產生與治療作用無關的副作用,甚至是對機體造成不可逆損害的毒性反應。因此,研究氣體信號分子在心血管線粒體的靶點和分子作用機制,有助于明確將其用于動物體內時可能出現的不良反應,從而有針對性地進行預防和監測,將脫靶效應降至最低。