基于蛋白質互作網絡挖掘自閉癥譜系障礙的功能模塊與核心基因

許逸聰,胡婉雪,謝 芹,趙洪波*,唐 欣

(昆明醫科大學a.分子臨床醫學研究院暨云南省干細胞和再生醫學重點實驗室；b.康復學院,中國云南昆明650500)

自閉癥譜系障礙(autism spectrum disorder,ASD)是一類常見的神經發育疾病,診斷標準包括持續的社會交流與互動缺失、語言障礙、刻板重復行為及狹隘的興趣。除上述癥狀外,患者可能同時伴隨有癲癇、睡眠障礙、抑郁、焦慮以及胃腸道活動紊亂等癥狀,表現出明顯的異質性和多樣性[1],這些癥狀在兒童早期出現并嚴重影響患兒的日常生活[2]。作為一種具有高遺傳性和生物復雜性的神經行為障礙類疾病,ASD是由遺傳、環境等復雜因素相互作用形成的,其中遺傳變異導致的發病率相對較高[3]。2016年發表的一項基于雙胞胎研究的薈萃分析指出,64%～91%的ASD風險是由遺傳因素引起的[4]。

盡管目前已發現上百種風險基因與ASD相關,表明ASD具有明顯的遺傳異質性,但遺傳背景有差異的ASD個體往往表現出相似的行為特征[5]。越來越多研究也表明,與ASD密切相關的基因可能匯聚于一些共同的生物學過程[6～7],在ASD發生過程中起關鍵作用,但尚未有研究系統篩選這些功能模塊和核心基因。因此,本研究利用生物信息學方法,通過疾病基因數據庫中報道的ASD相關基因信息,整合蛋白質互作(protein-protein interaction,PPI)網絡先驗知識,挖掘ASD的功能模塊和核心基因,并對每個模塊進行通路富集分析,為ASD的遺傳研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 基因集數據獲取

本研究從3個疾病數據庫收集ASD相關基因。AutismKB 2.0(http://db.cbi.pku.edu.cn/autismkb_v2/index.php)是ASD遺傳證據的知識庫[8],當前版本包含ASD相關的1 379個基因(99個綜合征自閉癥相關基因和1 280個非綜合征自閉癥相關基因)、5 420個拷貝數變異(copy number variation,CNV)/結構變異(structural variation,SV)、11 669 個單核苷酸變異(single nucleotide variation,SNV)/插入和缺失(insertions and deletions,InDels)以及與ASD相關的172個連鎖區域。SFARI Gene數據庫(https://gene.sfari.org/)收錄了1 089個ASD基因、2 290個CNV基因座和2 296個動物模型[9]。Dis-GeNET是一個綜合性疾病基因數據庫[10],整合了來自專家庫、全基因組關聯分析(genome-wide association study,GWAS)、動物模型和相關學術文獻的數據,通過“Autism Spectrum Disorder”進行檢索,得到571個相關基因。為獲得穩健的基因集,篩選出在3個數據庫中都出現的基因用于后續分析。

1.2 蛋白質互作網絡構建

交互基因檢索工具(Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes,STRING)是一種用于評價蛋白質相互作用的工具[11]。將篩選出的ASD基因集導入STRING在線工具(http://string-db.org),選擇物種為Homo sapiens,設置置信度閾值大于0.4,得到基因集表達的蛋白質互作網絡(PPI network)。通過Cytoscape 3.7.2軟件進行可視化和連通度分析,將篩選出的連通度大于25的節點作為PPI網絡的重要基因。

1.3 功能模塊及核心基因識別

利用MCODE(Molecular Complex Detection)算法對PPI網絡中的節點進行密度聚類[12]。首先排除連通度小于3的節點,計算納入節點的核聚類系數(core-clustering coefficient)并將其作為節點的權重,之后以當前節點權重百分率(vertex weight percentage,VWP)為閾值(本研究設VWP為0.2),篩選閾值范圍內的相關節點構建模塊,并將各模塊中所包含的基因作為核心基因。上述過程通過Cytoscape軟件中的MCODE插件進行,參數設置:degree cutoff≥3,K-score≥3,其余選擇默認值。

1.4 通路富集分析

采用R軟件包clusterProfiler[13]對得到的各功能模塊進行KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)通路富集分析,通過超幾何分布計算各通路富集結果的顯著性,并使用Bonferroni方法進行多重假設檢驗校正,以錯誤發現率(false discovery rate,FDR)小于0.05為標準,對富集結果進行篩選,得到顯著富集的KEGG通路。將富集到的KEGG通路輸入KEGG數據庫,識別其類別,進而評估功能模塊之間的相互作用,利用Cytoscape 3.7.2軟件構建功能模塊與通路分類的關系。

2 結果

2.1 ASD相關基因篩選結果

為獲得穩健的基因集,本研究共納入了AutismKB數據庫中的1 379個基因、SFARI Gene數據庫中的1 089個基因以及DisGeNET數據庫中的571個基因。通過取交集,最終篩選出共有的182個基因作為ASD相關基因集用于后續分析(圖 1)。

圖1 基于3個數據庫獲得ASD共同基因的Venn圖Fig.1 Venn diagram of common ASD genes from three databases

2.2 ASD基因集的蛋白質互作網絡

將182個ASD相關基因導入STRING數據庫,進行PPI網絡分析。結果顯示,整個網絡包含171個節點和1 041條邊,其中每個節點代表基因對應的蛋白質,每條邊代表兩個蛋白質之間的互作關系(圖2)。根據PPI網絡中每個節點的連通度,篩選得到PPI網絡中核心蛋白質的編碼基因23 個,分別為 NRXN1、GRIN2B、GRIN2A、DLG4、NLGN3、MECP2、CNTNAP2、BDNF、NLGN4X、FMR1、SHANK2、RELN、CHD8、SNAP25、CACNA1C、GAD1、PTEN、NRXN3、GABRB3、SYN1、SHANK1、SCN2A和UBE3A。

2.3 ASD疾病網絡中的功能模塊與核心基因

通過MCODE算法對PPI網絡進行分析,最終獲得5個功能模塊,包含68個核心基因(表1和圖3)。節點顏色越深表明該節點在其模塊網絡中的連通度越高,即其所代表的編碼基因在模塊網絡中的重要性越高。評分最高的模塊1(M1)包含20個基因及146條邊,平均每個節點含有7.3條邊,說明該模塊中的基因之間關系比較密切,其中排名靠前的基因有 GRIN2B、GRIN2A、DLG4、MECP2、NLGN3、CNTNAP2、NLGN4X、FMR1、SHANK2等。模塊2(M2)由20個基因和54條邊組成,平均每個節點含有2.7條邊,其中BDNF處于模塊核心位置。模塊3(M3)有16個核心基因,模塊4(M4)含有的核心基因最少,僅4個。

2.4 各功能模塊的通路富集分析

對篩選出的各個模塊進行KEGG通路富集分析,結果顯示:模塊M1顯著富集于谷氨酸能突觸、細胞黏附分子和物質依賴通路；模塊M2主要富集于突觸囊泡循環、多巴胺能神經突觸、神經活性的配體-受體相互作用等通路；模塊M3富集的通路有促性腺激素分泌、晝夜節律、MAPK信號通路、鈣離子通路等；模塊M4主要富集在免疫相關通路；模塊M5涉及到鈣離子通路和神經活性的配體-受體相互作用(表2)。分析模塊之間的共同通路發現,M1和M2都包括可卡因成癮通路,M1和M4都包括細胞黏附分子通路,M2和M5都涉及神經活性的配體-受體相互作用通路,M3和M5都包括鈣離子信號通路。

為了展示各模塊之間的關系,根據各模塊富集到的KEGG通路類別評估5個功能模塊之間的相互作用,構建模塊和通路分類的關系圖(圖4)。圖中的功能類是KEGG通路的分類,包括信號分子和相互作用(signaling molecules and interaction)、神經系統(nervous system)、物質依賴(substance dependence)、內分泌代謝病(endocrine and metabolic disease)、信號轉導(signal transduction)、轉運和降解(transport and catabolism)、環境適應(environmental adaptation)、免疫系統(immune system)、免疫疾病(immune disease)、細胞生長和死亡(cell growth and death)、內分泌系統(endocrine system)、傳染病(infectious disease)、循環系統(circulatory system)、抗藥性(drug resistance)、心血管疾病(cardiovascular disease)和腫瘤(cancer)。其中信號分子和相互作用(M1、M2、M4 和 M5)與神經系統(M1、M2 和M3)這兩個通路分類的連通度最高。

圖2 ASD相關基因的PPI網絡圖每個節點代表各基因對應的蛋白質,連接各節點的邊代表蛋白質之間的相互作用。節點連邊越多表示其連通度越高,在網絡中的位置越趨于中心,且顏色也越深。Fig.2 The PPI network of ASD related genesEach dot represents a protein corresponding to each gene,and the edge represents the interaction between the proteins.The center nodes with deeper color represent higher degree.

表1 各模塊的基本信息Table 1 Basic information of each module

3 討論

ASD是一種復雜的遺傳性神經行為障礙類疾病,目前已有一些ASD相關的分子機制的研究[14～15],但各獨立研究之間缺乏一個明確的共識。ASD的高異質性則表明,其發生發展涉及多種生物學過程的相互作用,而這些互作關系所涉及的具體機制尚不明確。本研究結合ASD疾病基因數據庫與蛋白質互作網絡先驗知識,構建了ASD風險基因網絡,通過網絡分解,挖掘出緊密聯系的功能模塊和核心基因,進而分析了各模塊的功能。為得到穩健的候選基因集,我們從3個數據庫獲取基因交集,增加了結果的可信度。分析結果顯示篩選得到68個核心基因,并提取了ASD相關的5個功能模塊。

圖3 各功能模塊網絡圖各節點代表功能模塊的核心基因,顏色越深表示該基因的連通度越大。Fig.3 Network of each functional moduleThe nodes represent the hub genes in functional module,and the deeper colors represent genes with higher degree.

圖4 功能模塊與通路分類關系圖藍色表示模塊,紅色表示通路分類。Fig.4 Diagram of functional modules and pathway classificationBlue indicates the module and red indicates the pathway classification.

表2 各功能模塊的KEGG通路富集分析結果Table 2 The results of KEGG pathway enrichment analysis in each functional module

為闡明模塊的生物學功能,本研究對每個模塊中的核心基因進行了基于KEGG信號通路的富集分析。評分最高的模塊M1主要與谷氨酸能神經元突觸形成及可塑性等過程相關。其中,NLGN3、NRXN3等基因編碼的神經連接蛋白(neuroligins,NLGNs)家族和神經軸突蛋白(neurexins,NRXNs)家族均為單次跨膜Ⅰ型蛋白家族。在谷氨酸能或γ氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)能神經元中,NLGNs蛋白家族位于突觸后膜,而NRXNs蛋白家族則位于突觸前膜。兩者可以相互結合并與SHANK3蛋白綁定形成復合物,在突觸的形成以及突觸間的信息傳遞等過程中起到核心調控作用[16]。GRIN2A及GRIN2B基因分別編碼N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate,NMDA)受體的2a及2b亞基,其在神經發育早期階段有著豐富的表達,并在發育后期的表達量逐漸降低,表明其主要參與神經系統的早期發育過程；此外,GRIN2B也在神經元的增殖遷移、軸突樹突形成、學習記憶及突觸可塑性等多種神經活動相關過程中起調控作用[17]。DLG4基因編碼PSD-95蛋白,該蛋白質是突觸后區域中一個特征明確的支架蛋白質,可與各種其他功能蛋白質相結合[18]。在突觸后神經元中,SHANK蛋白與PSD-95構成復合物,并與NMDA受體交聯,參與谷氨酸能神經活動調節的突觸可塑性[19]。FMR1基因編碼脆性X智力遲鈍蛋白 (fragile X mental retardation protein,FMRP),FMRP定位于神經元的胞體和樹突,通過與mRNA結合調節蛋白質合成,主要起轉錄抑制因子的作用。而SHANK蛋白家族則作為FMRP的下游靶標被調控[20]。CASK基因編碼鈣/鈣調蛋白依賴性絲氨酸蛋白激酶,在突觸前神經元中,通過與NRXNs結合構成復合物,從而連接細胞骨架,參與突觸可塑性的相關調節[21]。通過文獻挖掘和模塊網絡圖可以發現,M1中各核心基因之間關系緊密,任何部分的改變均可能導致谷氨酸能神經元突觸形成及可塑性過程的異常。比如:通過編輯小鼠的NLGNs蛋白家族相關基因發現,無論是這些基因的缺失還是過度表達,都可能導致小鼠出現ASD樣的行為表現和中樞興奮性與抑制性網絡環路的異常[22]；GRIN2B區域內的多個單核苷酸多態性 (single nucleotide polymorphism,SNP)與ASD的發病密切相關,不同的突變表型會影響Mg2+對Ca2+滲透性陽離子通道的電壓依賴性阻滯作用,從而導致異常的神經電活動[23～24]；CASK作為發育障礙相關的基因之一,其突變也在ASD患者中被發現[25]。此外,小鼠Fmr1的缺失導致功能性皮質內神經元連接的發育缺陷[26],興奮與抑制的失衡[27],軀體感覺皮層神經元網絡活動的同步性增加[28],以及視覺皮層中神經元電活動依賴的可塑性異常[29]。

模塊M2中包括的核心基因則與神經遞質的囊泡轉運等過程相關。APBA2編碼的蛋白質又稱MINT2,是神經元銜接蛋白家族成員之一,其通過與CASK蛋白結合,進而與NRXNs家族蛋白交聯,并構成一種轉運蛋白復合體[30]。該轉運蛋白復合體通過與CASK相連接的細胞骨架將Munc18-1等突觸囊泡相關蛋白質募集到NRXNs家族蛋白周圍,而Munc18-1是一種sec1樣蛋白,參與胞吐作用等神經遞質釋放相關的過程[31]。SNAP25與STX1A編碼的蛋白質共同參與構成可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體(soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor,SNARE)復合物[32],這種蛋白質復合物在Munc18-1的拉鏈作用促進下黏附谷氨酸或GABA遞質囊泡,并通過囊泡的依賴性膜融合開始突觸囊泡循環過程[33]。模塊M3的核心基因主要涉及突觸后膜電活性調節等相關過程。其中NOS1編碼神經元型一氧化氮合酶(neuronal nitric oxide synthase,nNOS),nNOS通過PSD-95與NMDA受體交聯,調節NMDA受體相關下游過程的激活,包括CACNA1C、CACNA1D等編碼的電壓依賴性鈣通道等,從而對突觸后區域的活性及可塑性進行調節[34]。

通過對功能模塊內核心基因的分析,我們發現NRXNs家族、PSD-95、CASK等以功能蛋白質復合物的形式參與ASD相關生物學過程。這些核心基因的異常將會影響模塊的功能,進而導致疾病的發生發展。根據富集到的KEGG通路類別,我們得到了更為深入的功能聯系,說明了模塊與模塊之間不是孤立的,而是相互作用,共同參與ASD演化的核心病理機制。

綜上所述,本研究通過數據庫挖掘及蛋白質互作網絡分析,篩選出了ASD相關的5個功能模塊,得到68個核心基因,它們匯聚于一些共同的生物學過程,如突觸傳遞、細胞間相互作用及細胞內信號傳遞的分子通路等。這些模塊和基因異常均會導致整體網絡的失衡,使得神經發育中的某些過程發生延遲或中斷,從而導致感知覺與學習記憶能力異常、晝夜節律障礙等ASD相關癥狀的發生。本研究對ASD基因信息的挖掘和整合,有助于進一步地了解ASD的分子機制,可為ASD的基礎研究提供新的參考。