家族性皮質肌陣攣震顫性癲癇CTNND2基因的檢測

劉彩霞， 孫 維， 田智敏， 陳秋惠， 史寶和， 孫亞娟， 李 佳

家族性皮質肌陣攣震顫性癲癇(Familial cortical myoclonic tremor with epilepsy，FCMTE)又稱良性成人家族性肌陣攣性癲癇(Benigh adult familial myoclonic epilepsy，BAFME)，是一種罕見的神經系統常染色體顯性遺傳疾病。盡管研究者已做了大量研究，但其發病機制仍不明確。目前在我國、日本、意大利、法國等多個國家已經發現了2p11-q12.2、10p15、8q23.3-24.1、5p15.31-p15、3q26.32-3q28等5個致病基因位點，我國報道的病例的致病基因位點主要位于5p15.31-p15和10p15，但目前尚未克隆出該病的致病基因。課題組在前期工作中通過連鎖分析，將致病基因位點定位在5號染色體的某一區段[1]，經過對該區段相關基因的功能分析，預測CTNND2可能為該FCMTE家系的致病基因，因此本研究對該家系中7例患者進行CTNND2篩查，以明確該基因是否為該家系的致病基因。本文將對其檢測結果做一報道。

1 對象與方法

1.1 對象 對確診的家族性皮質肌陣攣震顫性癲癇一家系包括先證者在內的7例發病者進行基因突變分析。此家系8例患者均成年發病，男女患病機會均等，除第Ⅳ代一人為可疑患病外，其余三代均有發病。發病成員無發育遲滯，多以震顫為首發癥狀，伴有癲癇發作、頭痛等癥狀，癲癇主要表現為強直-陣攣發作，多伴有焦慮癥狀，智能受損不明顯。口服地西泮、苯巴比妥、卡馬西平等藥物癲癇治療有效，但口服β受體阻滯劑或飲酒震顫控制不明顯。病情發展緩慢，無明顯進展過程。符合2005年Van Rootselaar提出的“家族皮質震顫性肌陣攣性癲癇”的診斷標準[2]，家系圖見圖1。

圖1 家族性皮質肌陣攣震顫性癲癇家系

1.2 方 法

1.2.1 基因組DNA 提取獲得受試者知情同意后，取其外周肘靜脈血各5 ml，利用血液基因組DNA提取試劑盒(天根)提取各樣本基因組DNA。

1.2.2 PCR檢測 建立PCR反應體系進行PCR反應，用1.0%的瓊脂糖凝膠進行 PCR產物電泳分析，割膠回收PCR產物并進行純化。

1.2.3 基因突變檢測 用于擴增的CTNND2基因編碼區包括22個外顯子的引物22對，根據CTNND2的gDNA序列，采用Primer3在線設計(由上海生物工程公司合成)，對PCR擴增產物進行測序，將GenBank人類CTNND2基因的gDNA序列與測序結果進行比較。CTNND2基因引物序列見表1。

表1 擴增CTNND2基因的引物

2 結 果

2.1 PCR檢測結果CTNND2基因檢測結果 見圖2。

2.2 CTNND2基因突變檢測 利用直接測序法對CTNND2基因進行測序，結果顯示除先證者CTNND2-18號外顯子序列只有F-前10bp判讀不清外，其余患者該基因均未見突變(見圖3)。

圖2 先證者CTNND2 PCR檢測結果圖

圖3 先證者CTNND2-18號外顯子序列檢測峰圖(只有F-前10bp判讀不清，其余未見突變)

3 討 論

家族性皮質肌陣攣震顫性癲癇(Familial cortical myoclonic tremor with epilepsy，FCMTE)是一種罕見的神經系統常染色體顯性遺傳疾病。成年期發病，主要表現為四肢細微震顫或肌陣攣，以遠端為著，伴或不伴癲癇發作，情緒緊張、光刺激或睡眠剝奪時易被誘發，抗癲癇藥物可有效控制癲癇發作，而飲酒或使用β受體阻滯劑治療無效，病程為非進展性。軀體誘發電位顯示肌陣攣或震顫來源于大腦皮質。我們在臨床工作中發現了一個FCMTE大家系，已對其臨床特點做了報道[3]。

目前，在我國、日本、意大利、法國等多個國家已經發現了2p11-q12.2、10p15、8q23.3-24.1、5p15.31-p15、3q26.32-3q28等5個致病基因位點，該病的致病基因至今仍不明確，我國報道的病例的致病基因位點主要位于5p15.31-p15和10p15[4～7]。課題組在前期工作中通過對家系成員進行連鎖分析，將致病基因位點定位在5p15.31-p15[1]，為進一步明確該家系致病基因，采用功能候選克隆的策略對候選基因進行篩查。通過在UCSC數據庫中的Human Genome Browser中查詢在5p15.31-p15之間的基因。根據癲癇的病理生理機制、已克隆的特發性癲癇致病基因特點，結合各個基因在該候選區域的表達及其生物學特性對候選基因進行選擇，而后將致病基因鎖定為CTNND2。

CTNND2 基因位于5 p15.2染色體上，是2p12 CTNNA2基因的旁系同源基因，編碼連環蛋白(鈣粘聯蛋白相關蛋白)，它是連環蛋白家族中的一種，可能參與了神經細胞黏附。該基因在中樞神經系統和視網膜中的表達更豐富，在大腦功能中扮演重要角色，包括突觸的監管[8，9]。

本實驗我們利用PCR產物測序方法對受試者CTNND2基因編碼區包括22個外顯子進行篩選。盡管此次外顯子篩查的結果為陰性，但仍不能完全排除該基因為致病基因。由于我們主要進行的是外顯子測序，并且以編碼區為主，未涉及非編碼區，而非編碼區的順式作用對于基因的時空表達起關鍵作用，順式作用元件的突變可能導致疾病發生。其次，除了基因本身的調控元件通過影響基因的表達水平導致疾病發生外，還存在修飾基因異常或修飾基因與基因間相互作用導致疾病發生的可能。另外，也不能除外嵌合突變的可能。但目前我們尚不考慮該基因為該家系致病基因，通過對該基因的篩查，雖暫時未發現陽性結果，但是能夠幫助我們縮小了篩選范圍。接下來，課題組將對候選區域的其他可疑致病基因進行篩查，必要的時候對家系成員進行全外顯子測序以尋找致病基因。