臍帶間充質干細胞治療失代償期肝硬化12例臨床療效觀察

薛超 馬文娜 孫慶文 李沖杰

近年來,隨著干細胞研究的興起，國內外陸續有關于干細胞臨床應用的報道[1-3]，但多局限于短期的療效觀察，缺乏嚴格的對照。本研究對乙肝肝硬化患者采用臍帶間充質干細胞經靜脈輸注移植聯合傳統的抗病毒等綜合治療方法，對其治療后半年臨床療效進行分析，現報道如下。

資料與方法

一、一般資料

選擇2017年10月至2018年3月山東醫專附屬醫院收治的失代償期肝硬化患者12例，其中男性8例，女性4例，年齡48～78歲，平均年齡57.4歲。12例患者均為乙型肝炎肝硬化，Child-Pugh分級：B級5例，C級7例。所有患者均行腹部B超和(或)CT 檢查，實驗室檢查包括ALT、AST、總膽紅素(TBil)、白蛋白(Alb)、膽堿酯酶(CHE)[4-6]。所有患者進行干細胞移植治療前均給予傳統控制水鈉攝入、保肝、糾正低蛋白血癥等內科綜合治療，所有患者在知情同意情況下簽署《知情同意書》。另選擇15例同時間段該院收治的失代償期肝硬化患者，年齡46-73歲，平均年齡56.8歲，只給予傳統內科綜合治療，作為對照組。

二、臍帶間充質干細胞采集、分離和鑒定

(一)臍帶干細胞采集 選擇臨沂市婦女兒童醫院產科剖腹產健康產婦, 排除乙型肝炎、丙型肝炎、艾滋病、梅毒以及其他傳染性疾病，無病理妊娠，胎兒娩出斷臍后，清洗消毒，裁剪約15～30 cm臍帶，置于裝有保存液的采樣瓶中，2 h內帶回實驗室備用。

(二)臍帶干細胞分離 用貼壁法分離提取臍帶間充質干細胞，提取試劑盒購自Gibco和Helios公司，耗材用品購自上海百賽生物技術有限公司。操作嚴格按照標準操作規程(SOP)進行分離提取，37°C、5% CO2濃度培養后，臺盼藍染色計數，每例臍帶提取間充質干細胞總數不低于1×109。

(三)臍帶干細胞鑒定 免疫熒光標記抗體CD29-APC、CD90-PE、CD105-FITC、CD34-PE和CD45-PerCP購自BD公司，細胞被抗體標記后上流式細胞儀進行檢測，收獲目的活性細胞不小于95%間充質干細胞。

三、移植方法

經計數和檢測合格的細胞，洗滌3次，徹底去除培養基殘留，按照5×107個/制劑的標準用生理鹽水稀釋制備成150 mL細胞懸液。經靜脈滴注，將含有臍帶間充質干細胞的150 mL生理鹽水懸液注入到患者體內，滴速為45～65滴/min，連續靜脈滴注3次，每次間隔1周。

四、療效觀察

觀察指標主要包括以下幾個方面：臨床癥狀、體征和不良反應；干細胞移植術后1周、4周、12周、24周肝功(ALT、AST、TBil、Alb、CHE)和B超等。

五、數據分析

結 果

一、臍帶間充質干細胞的鑒定

經分離培養的臍帶間充質干細胞大小均勻，呈長形或梭形。經全自動細胞計數儀檢測，間充質干細胞活率約為93%，高于業內85%的要求。培養細胞經流式細胞儀檢測，檢測結果CD29+、CD90+、CD105+、CD34-和CD45-等表面標志物提示目的細胞的比率分別為99.9%、99.9%、99.8%、99.9%和98.0%，符合目的細胞不低于95%的要求(圖1)。

圖1 臍帶間充質干細胞表面標志物流式檢測

二、臨床癥狀與體征變化

在接受干細胞治療的試驗組患者與對照組患者中，腹水、腹脹、下肢浮腫、納差、乏力等臨床癥狀均有不同程度的改善，在治療后24周左右，試驗組患者改善程度高于對照組患者。此外，試驗組患者中，有5例患者闡述其睡眠質量明顯改善，4例患者出現面容好轉。

三、肝功能變化

在干細胞治療試驗組患者和對照組患者中，肝功能指標均有不同程度的改善，在治療后12周時，除膽堿酯酶無明顯變化外，試驗組肝功能指標評估改善顯著高于對照組(P<0.05)，其中白蛋白變化尤為明顯，預示試驗組肝臟儲備功能改善良好，干細胞對患者肝臟功能起到良好的修復作用。在治療24周時，數據變化不再明顯，兩組患者對比差異無顯著意義(P>0.05)(見表1)。

表1 患者肝功能指標變化

四、不良事件與安全性

在所有接收臍帶間充質干細胞移植治療的患者中，移植成功率100%，術后出現發熱反應3例，均不超過38 ℃，未給予處理，8 h后自動消退；出現精神亢奮1例，次日恢復正常；未發生感染和白細胞下降等情形。術后跟蹤隨訪過程中，對照組因死亡失訪1例。

討 論

已有研究證實，干細胞在肝硬化環境中能夠增殖分化[8]，且已有諸多將自體骨髓干細胞應用于治療肝硬化患者的報道[7-8]。但考慮到肝硬化患者常伴有骨髓造血功能減退及骨髓增生不良，干細胞增殖分化能力下降，骨髓穿刺采集的骨髓干細胞數量很難達到干細胞移植治療需要的細胞數量，而且患者病情嚴重，患者不能耐受采集大量骨髓液，也不安全[4]。與之相比，人臍帶間充質干細胞具有取材方便，來源廣，數量充足，增殖分化能力強，免疫原性低，干性維持良好[9]的優勢，越來越受到醫生和患者的重視。

本研究對12例失代償期肝硬化患者，使用臍帶間充質干細胞進行靜脈輸注移植治療，治療后隨訪結果顯示，接收干細胞治療的多數患者臨床癥狀腹水消退，腹脹、下肢浮腫減輕、食欲和體力改善明顯；肝功能較治療前也有明顯好轉，且較對照組改善具有顯著差異性。研究結果表明，臍帶間充質干細胞移植治療能良好修復肝損傷，改善肝功能，并且安全可行，無不良風險。

目前，臍帶間充質干細胞移植治療肝硬化作為一種新的治療方法尚處于臨床探索階段，報道的研究普遍存在病例數量較少，跟蹤隨訪時間較短，缺乏對照和遠期療效評級不足等問題。本試驗雖然設置了對照組，但也存在數量較少，跟蹤時間較短等缺陷。臍帶間充質干細胞移植治療肝硬化長期療效評價還需要大量樣本和嚴格的對照研究，建立標準化移植方式、細胞數量等問題還需進一步研究和探討，促進干細胞移植后的完全轉化以更有效的重建和改善肝組織和肝功能也是今后研究的重點工作內容。