無菌動物在宿主腸道菌群研究中的應用*

馬思彥 王俊平 董麗娜 趙仲華

(1.山西醫科大學，太原 030012)(2.山西醫科大學附屬人民醫院消化內科， 太原 030012)(3.山西醫科大學附屬人民醫院中心實驗室，太原 030012)(4.山西大學生物醫學研究院，太原 030012)

通常實驗動物按照對微生物和寄生蟲控制程度分為無菌動物(GF)、悉生動物(GN)、無特定病原體動物(SPF)和普通級動物(CR)[1]。無菌動物是在其體內檢測不出任何生命體，包括細菌、病毒、真菌、原生生物和寄生蟲等[2]。由于無菌動物體內沒有任何微生物，因此可通過接種特定的一種或幾種微生物來控制動物體內微生物群的存在。應用無菌動物模型研究宿主腸道微生物，很大程度上避免了因宿主本身攜帶的微生物對實驗結果造成的影響,可提高實驗的準確度、靈敏度和可重復性。

1 無菌動物種類

1.1 無菌斑馬魚

1942年，Baker等首次報道了無菌魚類的研究[3]。近年來，相對于小鼠模型遺傳操作和治療藥物規模篩選等繁瑣的方法，斑馬魚以其獨特的解剖生理特點成為生命科學研究的新對象。斑馬魚(zebrafish) 是一種雜食性淡水硬骨魚，廣泛用于發育生物學、生理學、遺傳學、毒理學以及生殖生物學的研究[4-6]。其體外受精、胚胎透明、胚胎發育同步且周期短、與哺乳動物腸道相似的組織和功能以及腸道易于取樣、測量等特點[7]，使其成為研究腸道微生物的理想動物模型。宿主與微生物相互作用的許多方面只能在整個生物體內進行研究，斑馬魚作為一種模式生物，在感染生物學和共生微生物與宿主相互作用的研究中起到了很大的作用[8]。

1.2 無菌鼠

小鼠在解剖、細胞生理及基因組同源性上與人類高度相似、且便于管理操作，因而被作為經典的動物模型得到廣泛應用[9]，并且人體腸道菌群一旦在無菌小鼠體內成功定植, 就可以維持很長一段時間[10]。與小鼠相比，大鼠體型大、各項器官功能基本穩定、生理學特征易于研究、且認知行為等方面與人類更接近，是多種疾病的重要模式動物。

1.3 無菌雞

有研究表明，雞作為無菌動物模型，不僅其飼養過程簡單，進化史及成長背景清楚，并且其在孵化之前就能判斷其父母代是否達無菌狀態[11]。

1.4 無菌豬

無菌豬在解剖、生理、生物化學、遺傳及營養代謝等方面與人類高度相似, 且相對于無菌小鼠可更加精確地用于腸道菌群與人類健康關系的研究[12]，因此，無菌豬模型被認為是生物醫學研究與開發中的重要的轉化動物模型[13]。應用無菌豬構建動物模型，目前已在畜牧生產、生物學、免疫性疾病、食品營養、生物制劑[14-15]等方面顯示出廣泛的應用前景。

2 無菌動物模型的構建

無菌動物作為研究腸道菌群最適的動物模型，其建立需依賴完整的無菌培養系統，包括隔離器、傳遞窗、恒溫加熱裝置、照明燈、紫外殺菌燈和空氣過濾裝置等[9]。并且動物的飼養、實驗等操作均需在嚴格無菌條件下進行。

2.1 無菌斑馬魚

參照單穎等[9]的方法構建無菌斑馬魚模型，取成年斑馬魚1～2對放入新鮮過濾水中，隔離雌、雄魚。次日更換新鮮過濾水，讓其自然產卵。立即收集魚卵并用一次性滅菌吸管將受精卵轉移至無菌培養皿中。經無菌培養液清洗卵3次后加入適量無菌培養液，放入無菌培養隔離器，每12 h更換一次無菌液，直至標本生長發育至實驗標準，然后用一次性滅菌吸管采集斑馬魚周圍環境、斑馬魚體及胚胎培養液樣本，放入各種培養基中適宜溫度培養，涂片染色，檢測有無微生物的存在，明確是否符合無菌動物模型的要求。

2.2 無菌鼠

1959年成功培育出第一只無菌小鼠[2]。按照Al-Asmakh等[16]的方法，構建無菌小鼠模型需保證小鼠胎兒期在母體內即是無菌的。無菌剖腹摘除小鼠子宮囊，消毒后放置于無菌隔離器中，然后將囊內的幼體轉移至無菌鼠體內，之后在無菌隔離器內生長，經數代繁殖之后才可培育出無菌小鼠。無菌大鼠的培育主要由無菌剖腹產獲得，首先建立SD大鼠群，使其交配產生子代，子代由無菌剖宮取出至無菌隔離器中飼養，飼料、水一律要求嚴格無菌，特制灌胃器的使用有助于無菌大鼠哺乳成功[17]，最終檢測其生長環境及大鼠是否達到無菌動物的標準。

2.3 無菌雞

選取SPF(無特定病原體)雞蛋，無菌操作放入無菌孵化器中孵化，孵化的子代在無菌隔離器中飼養，飼料均經高壓蒸汽消毒后經隔離器傳遞倉對接送入。待動物生長到實驗要求的月齡數，檢查腸道(糞便)內有無細菌存在，無病原微生物即無菌動物模型建立成功。

2.4 無菌豬

1895年柏林大學培育出世界上第一批無菌豬，這些無菌豬僅存活了13 d[16]。1960年Landy等[18]在無菌隔離裝置基礎上構建了無菌實驗室,通過子宮切除術獲得無菌豬。

3 GF動物在腸道菌群中的研究應用

3.1 腸道菌群對機體生長發育的影響

動物腸道的生長發育直接影響宿主的生長和健康狀況，腸道微生物菌群的建立顯示了腸道菌群可能參與宿主腸道的發育[19]。在斑馬魚模型中，腸道微生物會影響機體的生長發育以及上皮再生和腸細胞形態[20]，若缺乏腸道微生物，幼魚腸的分化會停滯在某特定階段，同時引起其功能的改變，但此時引入微生物群落后，該現象可被逆轉[21-22]。Yossa 等[4]通過在魚飲食中添加抗生素抑制腸道微生物的生長來建立模型，發現斑馬魚出現生長減慢，死亡率升高等現象。腸道菌群還可影響腸道黏膜形態，Awad 等[23]通過實驗對比，在飼糧中添加益生菌，可顯著增加35日齡肉雞空腸和回腸的絨毛高度。此外，無菌鼠和普通鼠相比，肝、腎組織的蛋白表達水平均有顯著變化，免疫系統也存在一定差異[16,24]。根據腸-腦軸學說，微生物還被證明可以調節大腦的功能和發育。如，在無菌小鼠的大腦中觀察到前額葉皮層神經元的髓鞘增生及無菌小鼠杏仁核和海馬神經元的樹突在形態學上不同于對照組等[25]，無菌小鼠的大腦表達有缺陷的小膠質細胞，在微生物群落恢復到控制水平后，小膠質細胞被部分拯救[26]。最近的一項研究中發現，無菌小鼠體內接種與生長相關的嬰兒微生物群可影響神經元和少突膠質細胞的發育[27]。

3.2 對器官功能的影響

微生物菌群的存在可能影響器官的發育，進而改善功能。相比普通級小鼠，無菌鼠的肝臟體積和腸道總質量更小，腸道固有層和結腸壁更薄，更為突出的是無菌鼠有巨大的盲腸[16]。酒精過量攝入可誘發無菌小鼠更加嚴重的肝臟損傷和更加明顯的肝脂肪變性[28]。Semova 等[29]研究發現，正常斑馬魚較無菌斑馬魚脂肪酸的吸收更多，且無菌動物腸道黏膜細胞具有較低的代謝更新率，而微生物群落可維持消化道的功能[20,22]。

3.3 單菌的功能

Neely等[30]使用不同的鏈球菌感染斑馬魚，包括化膿鏈球菌與海豚鏈球菌，獲得了細菌半數致死量和斑馬魚存活曲線等數據。Davis等[31]建立了海豚分枝桿菌感染斑馬魚的方法，造成肉芽腫病灶模型，并發現斑馬魚因感染途徑和接種劑量的不同引發了不同程度的病變。有報道[32]無菌小鼠體內接種多形擬桿菌及史氏甲烷短桿菌時，果聚糖的發酵增加，桿菌的代謝產物增多，從而改善宿主的腸道功能。

3.4 與疾病的關系

Lee等[33]比較了無菌條件下飼養的小鼠與常規條件下飼養的小鼠后發現，實驗性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)明顯減弱。許多研究表明帕金森病的微生物群發生了改變[34-36]。Yano等[37]發現一個由20種產芽孢細菌組成的微生物組可以增加無菌小鼠機體血清素的產生水平,而這種外周血清素的水平和多種疾病的發生有關,如腸易激綜合征、心血管疾病等。最近一項針對首發精神疾病的研究，其中發現乳酸菌和雙歧桿菌的流行率與健康年齡匹配的對照組相比有所降低[38]。同時，動物模型也提示了腸道微生物在焦慮和創傷相關疾病中的作用[39]。

3.5 影響菌群的因素

Zeng等[40]以無菌小鼠為基礎構建人源菌群(HFA) 動物模型，發現腸道雙歧桿菌計數隨年齡增長而增加，而乳酸桿菌計數隨年齡增長而減少，表明年齡和應變影響HFA小鼠模型中的腸道微生物區系。

3.6 研究趨勢

斑馬魚作為一種重要的脊椎動物模型，在藥物篩選與遺傳研究方面具有獨特的優勢。用無菌小鼠研究約氏乳桿菌、長雙歧桿菌及大腸桿菌的動態變化及相互作用，結果提示細菌間的相互作用系統可能為研究復雜微生態系統基本規律提供基本法則[41]。Suárez等[42]研究發現，無菌小鼠機體中存在高水平的特定細胞因子,而抑制這種特殊信號或許會損傷抗生素誘導的皮下脂肪褐變過程、抑制腸道菌群剔除小鼠的葡萄糖表型,有助于開發治療肥胖等疾病的新型療法。與小鼠和人相比，小型豬具有豐富的上皮內γδT細胞，較高數量的γδT細胞受體能夠建立有效模型用于研究這些細胞如何快速地作用于腸道細菌抗原[13]。腸道菌群相關的健康研究以及潛在的器官移植供體仍是無菌豬作為模型動物的發展趨勢和研究方向，從而為動物和人類健康提供認識和治療疾病的基礎。

3.7 目前存在的問題

就現有的研究成果看，鼠模型中仍存一些問題：①小鼠獨特的生理、解剖結構和行為(如吞咽)難免會影響微生物群落。②在人體中沒有發現幾種在小鼠腸道中定居的細菌[9]。③無菌小鼠屬于嚙齒類動物, 與人體還存在非常大的差異, 用無菌小鼠模型模擬人體腸道菌群受到質疑[12]，因此在應用于人類時可能受限。在構建無菌大鼠的模型中，動物的喂養、食物的成分等也是造模的關鍵及面臨的問題。相對于小鼠模型，斑馬魚仍存在與人類親疏關系較遠，技術手段相對積累少等問題。由于品種不同，豬的大小和特征可能存在很大差異，同時，飼養時間、條件、食物的選擇都是無菌豬、無菌雞需考慮的問題。

4 小結

沒有任何一種動物可以恰當地符合人體所有的參數，只有熟悉可用的多種動物模型，才能根據其解剖學、生理學、代謝反應、遺傳免疫等來選擇符合特定研究的模式動物[13]。

通過無菌動物研究腸道微生物作用，更深入地了解常見腸道菌群對宿主生長發育、調節免疫、新陳代謝、生理遺傳、疾病、行為等的影響，促進對疾病的認識，進而為人類健康提供新的依據和思路。