銅綠假單胞菌外毒素A蛋白疫苗的研制現狀

李文桂，陳雅棠

重慶醫科大學附屬第一醫院 傳染病寄生蟲病研究所，重慶 400016

銅綠假單胞菌（Psendomonas aeruginosa）是一種院內感染的常見致病菌，用抗生素治療易產生耐藥性，需要探索其他治療方法。許多研究表明脂多糖、多糖、藻酸鹽、鞭毛或菌毛均可作為疫苗使用，但有許多缺陷，故需尋找其他抗原[1]。銅綠假單胞菌外毒素A（P.aeruginosaexotoxin A，PEA）編碼基因長約1.9 kb，編碼的蛋白相對分子質量（Mr）為66 000，由613個氨基酸殘基組成。研究表明，PEA含有252個氨基酸殘基的結構域Ⅰa、128個殘基的結構域Ⅱ、39個殘基的結構域Ⅰb以及194個殘基的結構域Ⅲ。PEA具有下述作用：呈現ADP-核糖基轉移酶的活性，既有較強的免疫原性，又有較好的佐劑效應，可作為黏膜佐劑使用；催化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）水解為煙酰胺（N）和腺苷二磷酸核糖（ADPR），ADPR結合EF-2后使其失活，導致肽鏈無法延長，從而阻止蛋白的合成[2]；抑制淋巴細胞的轉化，抑制外周血單核細胞（PBMC）產生TNF-α、IL-6、IL-10和IL-8等細胞因子[3-5]；誘導中性粒細胞、肥大細胞和鼠胚胎成纖維細胞發生凋亡，從而逃避免疫細胞的殺傷作用[6-8]；刺激小鼠肺泡的Ⅱ型上皮細胞產生H2O2及自噬相關蛋白LC3，引起細胞自噬[9]。大量研究表明銅綠假單胞菌的溫度敏感株D/1/8和E/9/9、甲醛滅活的疫苗株SBI-N以及PEA類毒素可誘導小鼠產生較好的保護力[10-12]，表明PEA抗原具有作為疫苗的潛力。在此，我們將對PEA蛋白分子、融合蛋白、耦合蛋白以及核酸疫苗等的研制現狀進行綜述。

1 PEA蛋白分子

Gilleland等[13]將20 μg PEA蛋白加鋁佐劑肌肉注射SD大鼠，初次接種后2、4周加強2次，初次接種后6周血清IgG升高，此時氣管內注射5×104CFU的PA01株進行攻擊，攻擊后1周免疫組的肺組織病理變化顯著減輕，計數存活率表明免疫組和對照組分別為72.2%（13/18）和0（0/18）。

將PEA與麥芽糖結合蛋白（MBP）或硫氧還蛋白（Trx）進行融合表達，不僅提高了蛋白的溶解性，而且有利于蛋白正確折疊和二硫鍵形成，最大限度地保持蛋白活性。胡曉梅[14-15]以PA01株基因組的DNA為模板擴增PEA基因，插入pSK-T得pSK-PEA，與pMAL-P2x重組得pMALPEA，將其轉化大腸桿菌BL21（DE3）株，篩選重組菌，IPTG誘導表達，Western印跡提示重組菌表達的Mr為112 000的PEA-MBP融合蛋白可被陽性血清結合。趙志強等[16]將PEA基因插入pBV221得pBV221-PEA，轉化大腸桿菌JM109株，篩選重組菌，40℃熱誘導30 min，Western印跡提示重組菌表達的Mr為69 000的PEA蛋白可被陽性血清結合。佟偉[17]將1917 bp的PEA基因插入pET32α得pET32α-PEA，轉化大腸桿菌BL21（DE3）株，篩選重組菌株，IPTG誘導表達，Western印跡提示重組菌表達的Mr為78 000的PEA-TrxA融合蛋白可被陽性血清結合。吳建勇[18]將PEA基因插入pET28α得pET28α-PEA，將其轉化大腸桿菌BL21（DE3）株，篩選重組菌，Western印跡提示重組菌表達的Mr為74 000的PEA-His融合蛋白可被陽性血清結合。劉祥等[19]將50 μg PEA-His蛋白皮下注射昆明種小鼠，初次接種后2、4周加強2次，初次接種后6周血清IgG滴度為1∶8000，這時腹腔注射1×106CFU銅綠假單胞菌PA01株進行攻擊感染，攻擊后5 d接種組和對照組的存活率分別為 60%（12/20）和30%（4/12）。Manafi等[20]將 100 μg PEA蛋白皮下注射BALB/c鼠，每周1次，連續6周，初次接種后7周血清IgG升高，此時建立10%的體表面積燒傷模型，建模后1 d皮下注射108CFU的PA103株進行攻擊感染，攻擊感染后70 d接種組和對照組的存活率分別為93.8%（45/48）和0（0/25）。

KDEL是內質網留置序列，與蛋白融合表達后可以保持蛋白的全部活性。PE38是一個截短的PEA分子，含有PEA的部分結構域Ⅱ（253-362）、全部結構域Ⅰb（381-420）和結構域Ⅲ（421-613）。Qaiser等[21]以PA01株基因組DNA為模板擴增1043 bp的PE38-KDEL基因，插入pTZ57R/T得pTZ-PE38-KDEL，與pET22b（+）重組得pET22b-PE38-KDEL，將重組質粒轉化大腸桿菌BL21（DE3）株，篩選重組菌，IPTG誘導，Western印跡提示重組菌表達的Mr為38 000的融合蛋白可被陽性血清結合。

用成對堿性氨基酸蛋白酶清除位點的11個氨基酸替代PEA的Ⅱ區，同時改造PEA的Ⅲ區與人Her2受體結合的6個氨基酸序列，將KDEL序列加入PE38的C端稱為Her2-PE38X7。Tehranizadeh等[22]人工合成Her-PE38X7編碼基因，插入pET21b（+）得pET21b-Her2-PE38X7，將其轉化大腸桿菌BL21（DE3）株，篩選重組菌，IPTG誘導，Western印跡提示重組菌表達的Mr為45 500的融合蛋白可被陽性血清結合，該融合蛋白具有穩定性強、活性高和毒性低等特點。

2 PEA融合蛋白

2.1 PEA-Fla

鞭毛的基本組成單元為鞭毛蛋白（flagellin，Fla），Fla可誘導宿主產生中和抗體[23]。將PEA和Fla的編碼基因融合是值得探索的方法。Tanomand等[24]以PA01株的基因組DNA為模板擴增1212 bp的PEA基因，以8821M株的DNA為模板擴增510 bp的Fla基因，采用重疊PCR合成1722 bp的PEA-Fla融合基因，插入pET22b得pET22b-PEA-Fla，將其轉化大腸桿菌BL21（DE3）株，篩選重組菌，IPTG誘導，Western印跡提示陽性血清結合重組菌表達的Mr為63 000重組蛋白。Farajnia等[25]將PEA-Fla融合基因插入pTZ57R得pTZPEA-Fla，與 pET22b重組得 pET22b-PEA-Fla，將其轉化大腸桿菌BL21（DE3）株，篩選重組菌，IPTG誘導，Western印跡提示重組菌表達的Mr為63 000的融合蛋白可被陽性血清結合。將20 μg重組蛋白加弗氏佐劑皮下注射BALB/c鼠，初次接種后21、42和72 d加強3次，初次接種后79 d血清IgG升高，初次接種后86 d腹腔注射7.5×107CFU銅綠假單胞菌Pa8821M株進行攻擊，攻擊后10 d，PEA-Fla免疫組、Fla免疫組、PEA免疫組和對照組的存活率分別為 80%（4/5）、60%（3/5）、40%（2/5）和20%（1/5）。

2.2 ntPE-M2e

若PEA的Ⅲ區553位谷氨酸殘基發生突變，PEA就喪失了ADP-核糖基酶活性，成為無毒形式的PEA（ntPE）。A型流感病毒的M2蛋白胞外區（M2 extracellular domain，M2e）是一種跨膜離子通道，通過改變細胞內部的pH值促進病毒增殖。M2e的氨基酸序列保守，具有一定的免應原性[26]。徐一等[27]將M2e的編碼基因插入pET30αntPE得pET-ntPE-M2e，將其轉化大腸桿菌BL21（DE3）株，Western印跡提示重組菌表達的Mr為72 000的融合蛋白可被陽性血清結合。將200 μg融合蛋白加弗氏佐劑皮下注射BALB/c鼠，初次接種后3、6周加強2次，初次接種后7周血清IgG滴度為1∶7800，ELISPOT證實脾IFN-γ+SFC數目增加，初次接種后8周腹腔注射5 LD50的APR348株進行攻擊感染，攻擊后2周接種組和對照組存活率分別為100%（10/10）和20%（2/10）。

2.3 PEIF

外膜蛋白F（outer membrane protein F，OprF）和I（OprI）是嵌合在銅綠假單胞菌脂多糖和磷脂層外膜上的蛋白，主要參與微孔的形成，用它們免疫小鼠均可誘導較好的保護力[28]。Chen等[29]以pJH4為模板擴增PEA1-405編碼基因，插入pET-15b得pET-PE，然后以PA01株的基因組DNA為模板擴增OprI19-83和OprF(24-380)編碼基因，先后插入pETPE得pETIF，將其轉化大腸桿菌BL21（DE3）株，篩選重組菌，Western印跡提示重組菌表達的Mr為90 000的融合蛋白可被陽性血清結合。將10 μg融合蛋白腹腔注射BALB/c鼠，初次接種后3、5周加強2次，初次接種后6周血清IgG升高，此時制作30%體表面積的燒傷模型，燒傷1 d后皮下注射5×104CFU銅綠假單胞菌PA103株進行攻擊感染，攻擊后10 d接種組和對照組的存活率分別為80%（8/10）和0（0/10）。

2.4 PEA-GP5-M

豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）是豬繁殖與呼吸綜合征的病原體。包膜糖蛋白GP5和非糖基化的膜蛋白M通常形成異二聚體，與巨噬細胞的CD163受體結合，在病毒侵襲中起作用，同時可誘導中和抗體產生[30]。Yang等[31]制備PEA-GP5-M融合蛋白，將3 mg融合蛋白加1 mL ISA206佐劑肌肉注射28 d齡的仔豬，初次接種后2周加強1次，初次接種后4周血清IgG升高，ELISPOT提示PBMC中IFN-γ+SFC數目增多，此時肌肉注射5×105TCLD50銅綠假單胞菌TC-01株進行攻擊，攻擊后3周免疫組的肺病理變化明顯減輕。

2.5 CVN-PE38

CVN是藍細菌（Nostoc ellipsosporum）分泌的一種蛋白質，可與Ⅰ型人類免疫缺陷病毒（HIV-1）的gp120結合，具有抗病毒作用。Mori等[32]將CVN的編碼基因L插入pPB57得pPB57-L，與pUC19-PE38重組得pPB57-L-PE38，將其轉化大腸桿菌BL21（DE3）株，篩選重組菌，IPTG誘導，Western印跡提示重組菌表達的Mr為49 300的融合蛋白可被陽性血清結合，H9細胞模型提示該融合蛋白可提高gp120+H9細胞的毒性。

2.6 PEA-V3MV26

Mrsny等[33]將HIV-1的gp120蛋白V3環26個氨基酸插入PEA的Ⅰb區，稱為PEA-V3MV26，然后將20 μg融合蛋白加弗氏佐劑皮下注射BALB/c鼠，初次接種后2、7周加強1次，初次接種后8周免疫鼠的血清IgG、IgG1、IgG2a和IgG3水平明顯提升，唾液IgA水平也顯著升高。

2.7 PEA-HphA

HphA基因編碼一種組氨酸類似蛋白，該蛋白具有結合DNA的特性。PEA的Ⅰa區和Ⅱ區結構域可作為受體介導的基因傳遞載體，HphA基因與其融合并不影響DNA的序列或形態，可以提高DNA的轉染效率。Deng等[34]將HphA基因插入pET26α-PEA得pET26α-PEA-HphA，將其轉化大腸桿菌BL21（DE3）株，篩選重組菌；Western印跡提示重組菌表達的Mr為50 000的融合蛋白可被陽性血清結合。研究提示該融合蛋白可增加質粒轉染CHO細胞的效率。

2.8 IL-18-PE38

PE38具有極強的細胞毒性，常被用作分子佐劑[35]。IL-18是一種Th1型細胞因子，可將IL-18與PEA融合表達，利用IL-18將PEA導向Th1靶細胞，發揮其殺傷作用，常用于自身免疫性疾病的治療。李虹等[36]以小鼠總RNA為模板擴增480 bp的IL-18基因，插入pRKL459K得pRKLIL-18-PE38，將其轉化大腸桿菌 BL21（DE3）株，篩選重組菌，Western印跡提示重組菌表達的Mr為56 000的融合蛋白可被陽性血清結合。

3 PEA耦合蛋白

3.1 PEA-LPS

化學耦聯常用于病原體的蛋白、多肽和多糖疫苗，通過與載體蛋白的耦聯，使它們成為全抗原，從而提高耦聯抗原的免疫原性。PEA是一種T細胞依賴性抗原，常作為半抗原的連接載體，從而提高半抗原的免疫原性[37]。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是銅綠假單胞菌的內毒素，可誘導宿主產生抗體反應[38]。Cryz等[39]將PEA與LPS耦合為PEA-LPS，然后將50 μg耦合物加鋁佐劑肌肉注射新西蘭大白兔，初次接種后14、28 d加強2次，初次接種后42 d血清IgG升高。接著，Schaad等[40]將25 μg耦合物肌肉注射囊性纖維化的患者，初次接種后2、12個月加強2次，初次接種后13個月治療組的血清IgG升高。

3.2 PEA-CSP

惡性瘧原蟲（Pf）是惡性瘧的病原體，Pf環子孢子蛋白（PfCSP）是一種紅前期抗原，Mr通常為40 000～60 000，在子孢子入侵肝細胞的過程中發揮作用。Fries等[41]將400 μg CSP-PEA加鋁佐劑肌肉注射19名健康志愿者，初次注射后8周加強1次，初次注射后10周52%（11/19）接種者的血清IgG大于9.8 μg/mL；初次注射后16周加強第2次，初次注射后20周40%（4/10）接種者的血清IgG大于6 μg/mL。此時用2只感染Pf的斯氏按蚊叮咬接種者5 min，叮咬后2周免疫組和對照組的原蟲血癥分別為25%（1/4）和33.3%（1/3），研究表明免疫組的血清可抑制Pf子孢子入侵肝細胞，抑制率為90%，但抑制率與保護力無關聯。

3.3 PEA-Pfs25

Pfs25是Mr為25 000的受精后抗原，在動合子穿透蚊胃上皮以及動合子轉為卵囊的過程中起重要作用。錢鋒等[42]將Pfs25與PEA耦聯為Pfs25-PEA。Shimp等[43]將2.5 μg耦合物加鋁佐劑皮下注射CD1鼠，初次接種后4周進行加強，血清IgG在首次注射后6～15周提升明顯，首次注射后6周提升到較高水平；膜飼養試驗表明，1∶4和1∶8稀釋的初次接種后6周鼠血清的減囊率分別為99.0%和91.6%，而對照血清為0。

3.4 CD4-PEA

CD4是HIV-1結合T細胞的受體，Berger等[44]證實CD4-PEA耦合物可選擇性殺傷HIV-1感染的T細胞，但不殺傷表達MHCⅡ類分子的正常T細胞。

3.5 G17-PE38

胃泌素 17（gastrin 17，G17）是縮膽囊肽 2R（CCK2R）的受體。G17-PE38是一種免疫毒素，通過G17與胃癌細胞上的CCK2R受體結合，將PE38靶向胃癌細胞，發揮細胞毒作用。Feng等[45]將G17-PE38融合基因插入pET28α得pET28α-G17-PE38，將其轉化大腸桿菌BL21（DE3）株，篩選重組菌，Western印跡提示表達的Mr為43 000的融合蛋白可被陽性血清結合，細胞毒試驗表明該蛋白對胃癌細胞株BGC-823、MGC-803和SGC-7901均具有細胞毒作用。

3.6 PLGA-PEA

多聚乳酸羥乙酸（PLGA）是一種可生物降解的多聚體，由其包裹形成的納米顆粒可增強抗體的免疫應答，可作為抗原的傳遞載體[46]。Zanjani等[47]用PLGA包裹PEA，形成PLGA-PEA耦合物。將100 μg耦合物肌肉注射BALB/c鼠，初次接種后2、4周加強2次，初次接種后6周血清IgG提升顯著，脾細胞產生大量IL-4、IFN-γ、TNF-α和IL-17A等活性分子，這時腹腔注射1.5×108CFU的PA01株進行攻擊感染，攻擊后3 d接種組的脾臟內細菌負荷顯著減少。

4 PEA核酸疫苗

4.1 反義RNA

反義RNA在RT+細胞內反轉錄一個無毒性的RNA，與表達毒素的cDNA結合，抑制其轉錄，導致細胞死亡。反義RNA治療并不依賴反轉錄（RT），因它不表達有意義的毒素，但能降低轉染細胞的活性。HaHafkemeyer等[48]將PEA的反義RNAP92、P95、77和 P100插入 pCMVβGa1得pCMV-P92/P95/p77/P100，將其轉染鴨乙肝病毒（DHBV）感染的HepG2細胞，篩選培養，RT-PCR證實重組質粒可抑制DHBV的轉錄。

4.2 重組質粒

Denis-Mize等[49]以pGW580為模板擴增PEA基因，插入 pVR1012得 pVR1012-PEA，轉染UM449細胞，篩選培養，Western印跡提示陽性細胞表達的Mr為67 000的PEA蛋白可被陽性血清結合。將100 μg重組質粒肌肉注射BALB/c鼠，血清IgG在接種后3～5周升高，接種后5周達較高水平；RT-PCR證實接種后35 d淋巴結細胞內IFN-γ mRNA轉錄增加，但IL-4無變化；此時腹腔注射2.6 μg PEA毒素進行攻毒試驗，10 d后接種組和對照組的存活率分別為80%（8/10）和0（0/10）。Shiau等[50]將 1.66 kb的 PEA 基因插入pSecTagXpress得pSecTag-PEA，將其轉染3T3細胞，篩選培養，Western印跡提示陽性細胞表達的Mr為62 000的PEA蛋白可被陽性血清結合；借助肌肉注射將100 μg重組質粒接種BALB/c鼠，首次注射后2、4、6和8周重復4次，血清IgG在首次注射后3～11周提升明顯，首次注射后9周提升到較高水平；首次注射后10周腹腔注射1 μg PEA毒素進行攻擊，攻擊后1周免疫組和對照組的存活率分別為100%（5/5）和0（0/5）。

銅綠假單胞菌低鈣反應蛋白V（P.aeruginosalow-calcium response protein V，PcrV）是一種Ⅲ型分泌系統（T3SS）的轉運蛋白，具有一定的免疫原性[51]。Jiang等[52]以PA01株基因組的DNA為模板擴增PEA和PcrV基因，將其分別插入pIRES的2個位點得pIRES-PEA-PcrV，將重組質粒轉染HEK-293細胞，篩選培養，Western印跡提示感染銅綠假單胞菌的血清可結合陽性細胞表達的Mr為70 000的PEA和33 000的PcrV蛋白；借助肌肉注射將100 μg重組質粒注射BALB/c鼠，首次注射后2、4周重復2次，首次注射后5周血清IgG升高，脾細胞增殖，分泌高水平的IFN-γ和IL-12；初次接種后6周用5×107CFU銅綠假單胞菌PA01株進行滴鼻攻擊，攻擊后3 d免疫組的肺組織病理變化減輕，肺組織內的細菌負荷大量減少。

5 結語

現有部分銅綠假單胞菌PEA蛋白疫苗接種小鼠可產生免疫應答，但誘導的保護力水平一般較低，離期望值甚遠。重組PEA抗原的免疫原性較低，常須加用佐劑或與其他抗原進行融合以及耦合表達才能誘導有效的保護力；核酸疫苗可誘導全面的細胞和體液免疫應答，但其有整合進宿主基因組的風險；尚未深入研究這些疫苗的免疫機制；尚未建立疫苗效果的標準化和規范化的評價體系；尚未弄清疫苗的免疫途徑、劑量、次數、間隔以及末次免疫后菌株攻擊時間；尚欠缺新型PEA疫苗研制的創新思維。

隨著核基因組學、泛基因組學、蛋白質組學、高通量測序和反向疫苗學等學科的進展，大家勢必聚焦銅綠假單胞菌的基因組學、蛋白質組學及代謝組學的研究，從而闡明PEA結構與功能的關聯；為了提升DNA疫苗的免疫效果，可對PEA抗原表位的序列進行修飾，構建PEA多抗原表位或免疫增強序列-PEA抗原表位的融合基因疫苗，構建PEA表位-佐劑序列或不同抗原表位序列的融合基因疫苗；同時應努力探索新型疫苗載體，多管期下，積極推動銅綠假單胞菌PEA蛋白疫苗的研究步伐。