Raf激酶抑制劑蛋白與腫瘤干細胞相關因子的相互作用

趙楠，李玉花，楊雪,張俐佳，劉巖

1.黑龍江中醫藥大學 附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040；2.東北林業大學 生命科學學院，黑龍江 哈爾濱 150040

Raf激酶抑制劑蛋白（Raf kinase inhibitor protein，RKIP）是磷脂酰乙醇胺結合蛋白家族的成員，其既能抑制激活絲裂原胞外信號調節激酶Raf，又能活化B細胞途徑的核因子κ輕鏈。在惡性腫瘤中，RKIP對藥物/免疫介導的細胞凋亡具有轉移抑制和化學免疫增敏作用，且惡性腫瘤大多數表現出RKIP的低水平或無水平。腫瘤干細胞（cancer stem cell，CSC）是腫瘤中具有干細胞特性的一類細胞，既具備高度增殖能力與自我更新能力，也具備多向分化潛能。雖然腫瘤干細胞在腫瘤組織中只占極少的一部分，但卻在腫瘤發生發展過程中起著決定性的作用。而這些干細胞大多數處于靜止狀態，能夠逃避或抵抗化療藥物的毒性作用，是腫瘤復發和轉移的根源。腫瘤中維持干細胞自我更新和增殖機制的一些調控因子的研究是腫瘤干細胞研究的重要內容，如Oct4、KLF4、Sox2和Nanog是目前公認的干細胞調控因子。因為RKIP在腫瘤耐藥和轉移中的作用，它們的活性在一定程度上與上述幾種腫瘤干細胞轉錄因子介導的活性形成了對比。研究表明，RKIP與腫瘤干細胞相關因子如Oct4、KLF4、Sox2和Nanog在信號通路中存在復雜的相互作用，通過相互作用分析認為RKIP的表達水平可能參與了腫瘤干細胞表型的調控。如果上述交互作用存在，說明RKIP的誘導可能在CSC中起到轉移抑制和化學免疫增敏作用，將為開發新的藥物來誘導RKIP的表達，從而直接抑制調節CSC表型的轉錄因子，并使整個腫瘤對各種化學免疫治療方式敏感帶來新的希望。

1 RKIP概述

磷脂酰乙醇胺結合蛋白1（phosphatidylethanolamine binding protein 1，PEBP1）被發現可以通過直接與Raf-1結合來抑制Raf-1/有絲分裂原細胞外信號調節激酶/細胞外信號調節激酶（Raf/MEK/ERK）途徑。PEBP1被重新命名為Raf激酶抑制劑蛋白，它是一種表達于多種生物體和組織中的調節分子，參與多種細胞內信號網絡調控。

自發現以來，RKIP已被證明與鴉片類嗎啡-6-葡萄糖醛酸苷等疏水性小配體結合。RKIP是第一種內源性蛋白質，通過直接的蛋白質-蛋白質相互作用與Raf-1結合，抑制有絲分裂原活化蛋白激酶（MAPK）的級聯。RKIP對信號通路的表達和強度的復雜控制表明它在許多細胞過程中的重要性，包括細胞周期、細胞轉化、凋亡、心肌細胞收縮性、腫瘤進展和轉移抑制[1-2]，尤其是在前列腺癌和乳腺癌中。在前列腺癌基因小鼠模型中，RKIP表達的缺失被發現可以加速腫瘤的進展和轉移[3]。

人類RKIP基因位于12q24.23號染色體，由4個外顯子和1個獨立的主轉錄本組成。RKIP蛋白相對分子質量為23 000，含有187個氨基酸殘基，在人類、牛和植物中均有表達。RKIP的三級球狀結構包含一個疏水空腔（作為配體結合囊）和一個與磷脂酰乙醇胺結合的PE結合域，配體結合域也參與了Raf/MEK結合。

2 RKIP在腫瘤組織中的表達

RKIP表達水平的降低通常與多種腫瘤類型和腫瘤發生有關，RKIP的丟失通常會加速腫瘤的進展，而RKIP的過表達通常會阻礙腫瘤的發生和轉移。在B細胞淋巴瘤中，RKIP可以降低活化的Raf的反應，RKIP表達的增加與抗CD20治療誘導的B細胞凋亡的增加有關。此外，高水平的RKIP與B細胞淋巴瘤細胞Ramos對嵌合抗CD20小鼠/人單克隆抗體引起的腫瘤壞死因子相關的凋亡誘導配體（TRAIL）的敏感性有很強的相關性。因此，RKIP與B細胞淋巴瘤組織對凋亡的敏感性有關[4]。

與正常細胞相比，膀胱移行細胞癌（TCC）中RKIP mRNA的轉錄調控降低。RKIP表達的翻譯調控決定了腫瘤進展和淋巴管浸潤的程度。對膀胱癌的進一步研究表明，RKIP水平的降低可能與浸潤性表型相關。在腦癌中，RKIP表達下調主要見于膠質瘤和膠質母細胞瘤[5]。RKIP因其標志著惡性進展因此在腦癌中作為一種生物標志物發揮作用，而RKIP表達的減少與細胞遷移和轉移有關。

在乳腺癌中，浸潤性癌細胞中RKIP表達下調，而淋巴結轉移癌細胞中RKIP完全喪失。研究表明RKIP是一種轉移抑制因子[6～7]，RKIP表達的減少促進轉移，RKIP表達的增加抑制了MDAMB-231乳腺癌細胞的轉移和侵襲能力[8]。另一項發現顯示RKIP是基質基因的調節因子，可以阻止乳腺癌骨轉移。RKIP上調也可誘導化療中癌細胞凋亡。

與正常黏膜相比，RKIP在結直腸癌組織中的表達下調，在轉移性結直腸癌細胞中的表達進一步降低，RKIP的降低也與結直腸癌的轉移和血管侵犯有關。RKIP在大多數食管鱗狀細胞癌患者中表達減少[9]，并與預后不良相關[10]。RKIP啟動子高甲基化的發現表明RKIP在基因水平上的轉錄活性有助于RKIP表達的減少。與正常組織相比，RKIP在胃癌中的表達下調[11～13]，在胃癌患者淋巴結轉移中的表達進一步下調，這證實了RKIP作為轉移抑制蛋白的作用。

與正常組織表達相比，卵巢癌細胞RKIP水平明顯降低，侵襲能力增強，提示RKIP可能是一種轉移抑制基因。RKIP表達上調抑制卵巢癌的轉移和進展。在宮頸癌中也發現RKIP表達降低，與順鉑化療中轉移潛能增加、腫瘤血管化能力增強和細胞凋亡抵抗有關[14]。RKIP在肝細胞癌中表達下調，很可能是甲基化導致的[15]。RKIP上調抑制肝細胞癌腫瘤的生長和細胞遷移。RKIP mRNA在大多數非小細胞肺癌組織中的表達減少，在轉移組織中的表達進一步減少。RKIP和E-鈣黏蛋白的表達降低可促進非小細胞肺癌的侵襲和轉移[16]。

鼻咽癌組織中RKIP的表達水平明顯低于正常鼻咽上皮組織。與非轉移性前列腺癌組織相比，RKIP在大多數原發性前列腺癌細胞中的表達顯著降低，甚至在轉移性組織中的表達進一步降低。RKIP下調與大量腎癌及預后不良的病例有關[17]。少數臨床前研究表明，RKIP表達降低與甲狀腺癌進展有關，而RKIP表達上調與腫瘤的抑制有關，總體而言，RKIP表達是淋巴結轉移的重要標志。臨床前研究表明RKIP是一個具有統計學意義的重要生物標志物。所有證據都表明RKIP是一種轉移抑制因子和預后不良的標志物。

3 RKIP與腫瘤干細胞因子之間的相互作用

3.1 RKIP與Oct4

Oct4作為POU5F1基因編碼的轉錄因子，對Sox2和Nanog等其他轉錄因子起著積極的調節作用。Oct4作為維持胚胎干細胞狀態的轉錄因子家族的重要組成部分是不可替代的，因為它不能被來自同一蛋白家族的任何成員所取代[18]。Oct4的主要功能之一是維持多能干細胞的狀態[19]。在胚胎干細胞中通過某些轉錄因子的上調可能與腫瘤干細胞（包括Oct4）的多能性維持、DNA的修復、復制和穩定之間可能存在聯系[20]。Oct4敲除表達實驗中，Sox2和Nanog顯著降低，這支持了這3種轉錄因子協同工作以保持人類胚胎干細胞（hESCs）中細胞處于多能性細胞狀態的理論[21]。在激活Oct4基因表達的誘導物中，FoxD3、Nanog、Lin28誘導的激活以及Oct4本身起著控制Oct4水平的作用。在負反饋回路中，Oct4的表達增加會導致Oct4與Nanog啟動子結合，抑制Nanog基因的轉錄，從而降低Oct4的表達。

RKIP通過誘導miRNA結合蛋白Lin28參與Oct4的功能和調控。RKIP抑制Lin28的表達，進而上調參與CSC狀態激活的Let-7 miRNA。另一方面，Lin28也誘導Oct4的表達。因此，RKIP可能通過Lin28間接下調Oct4的表達。Lin28的表達減少，導致Oct4介入了分化的誘導，與Oct4作為“多潛能守門人”的角色保持一致。Oct4是一種保持平衡的精巧蛋白，Oct4的表達水平降低或增加50%可以誘導胚胎或滋養外胚層譜系的分化，影響正常細胞表型狀態的維持。

通過與Ras的靶分子Raf-1結合抑制MAPK通路，而過表達的Stk40細胞中Ras表達增加。此外，Stk40可以通過Rcn2誘導ERK的活化，但具體機制尚不清楚。除了上述機制外，還可能存在Oct4、白血病抑制因子（LIF）/Stat3與另一個核心轉錄因子在類CSC狀態細胞多能性調控的KLF4之間交叉的信號通路。因此，RKIP在Stat3通路中的作用可能提示了RKIP與Oct4之間的串擾通路機制，也可能是RKIP與KLF4之間的串擾通路機制。

3.2 RKIP與KLF4

KLF4是一種鋅指蛋白轉錄因子，通過上調p21的轉錄并抑制細胞周期蛋白D1來抑制細胞生長。KLF4具有多種功能，包括在乳腺癌細胞中作為鈣黏蛋白的增強子，在前列腺癌細胞中作為Slug/Snail2的抑制子。其主要作用是通過將KLF4與miRNA-7（miR-7）基因中可能的2 個 3′非翻譯區域中的結合，作為miR-7的底物。研究發現，下調KLF4的表達可以抑制乳腺癌細胞中CSC向腦轉移，而不是向骨轉移。同時也發現miR-7的表達與KLF4的表達呈負相關，其中miR-7的上調導致KLF4的表達下降[22]。

KLF4與RKIP之間不直接相互作用，而是通過調節MAPK通路中的Oct4/Sox2/KLF4復合物間接相互作用。RKIP的表達與Lin28和Let-7的表達導致Oct4表達下調有關，為了維持細胞的多能性，Oct4和Sox2結合在一起形成異源二聚體，然后鎖住KLF4的C端區域的不同結合位點，Oct4/Sox2/KLF4復合物將與Nanog啟動子結合，轉錄允許細胞多能性轉變和維持的基因。

此外，在Oct4、KLF4和Nanog存在下，Let-7的表達促進了CSC從誘導多能干細胞狀態向分化的過程[23]。RKIP被認為是一種轉移抑制因子和入侵表型的抑制劑。RKIP、Let-7、KLF4的表達結合可以上調CSC的分化，降低CSC的增殖，降低CSC的總可用頻率。

RKIP與KLF4的一個聯系是eHSP90與MAPK通路的聯系。KLF4調節細胞內伴侶分子HSP90，HSP90參與重要信號分子如Raf-1的正確折疊。KLF4與RKIP之間的另一個聯系可能涉及p53和p21的調節。已知RKIP誘導p53介導的細胞凋亡并抑制腫瘤轉移，而KLF4上調依賴于p53的p21表達[24～25]。

3.3 RKIP與Sox2

Sox2被認為是一種致癌轉錄因子，其調節受Oct4的影響。Sox2可能是肺癌和食管鱗癌中細胞去分化過程中恢復多能干細胞狀態的重要組成部分，但對胚胎干細胞的維持并不重要。Sox2的主要作用之一是通過Sox2抵消Sox3的表達來進行hESCs的自我更新。如果同時刪除Sox2和Sox3，則喪失了自我更新和細胞分化能力。然而，Sox2的缺失導致了Sox3的表達，而在hESCs中Sox3的表達較低，但hESCs的自我更新能力是完整的[26]。

此外，翻譯后修飾可以極大地影響Sox2的活性。研究發現，Sox2的類泛素化修飾阻礙了其與DNA的結合能力，而Oct4的類泛素化修飾則起到相反的作用，有助于與DNA的結合親和力。研究發現在Lys75殘基處抑制Sox2的乙酰化可阻止Sox2的核易位，并繼續導致Sox2靶基因的高乙酰化表達。此外，Sox2乙酰化的上調通過泛素化和蛋白酶體降解降低了Sox2的表達，這表明Sox2乙酰化是Sox2功能的主要調節因子。

RKIP介導的Sox2調節是通過抑制Oct4間接實現的。當RKIP抑制MAPK通路時，也抑制ERK的激活。因此，Myc被抑制，它通過RKIP介導的Let-7上調來抑制Lin28的表達，Let-7是一種阻斷Lin28活化的miRNA。最后，事件的級聯抑制了Oct4的表達。Oct4和Sox2相互作用形成一個異二聚體復合物，與KLF4結合到Nanog啟動子上，激活Nanog基因表達。值得注意的是，Sox2即使不與Oct4形成異二聚體復合物，也能與Nanog基因結合這種單體相互作用可以通過色氨酸和酪氨酸殘基堆積來調節胚胎干細胞的自我更新。

3.4 RKIP與Nanog

作為一種轉錄因子，Nanog通過調節Oct4、Sox2、KLF4和自身的表達，在多能性和胚胎干細胞中發揮多方面的作用[27]。Nanog蛋白含305個氨基酸殘基，它含有一個DNA結合區、一個同源框結構域和C端富含色氨酸的區域[28]。Nanog的調節可以通過多種途徑進行，如與MAPK途徑和Lin28-Let-7級聯的間接聯系以及與LIF-STAT-3途徑的直接聯系。Nanog的轉錄表達受多種CSC相關轉錄因子的復合物調控，包括Oct4、Sox2、KLF4、Nanog本身和其他因子。Oct4/Sox2異二聚體直接與Nanog基因結合以增加其表達。因此，Oct4、Sox2和Nanog的過度表達與腫瘤的發生有關[29]。這些轉錄因子的微妙平衡影響著細胞的命運和干細胞的表型。

Nanog被認為是CSC狀態類型的關鍵誘導因子之一，因為它在維持多能性方面具有潛在的作用，并且是細胞凋亡和細胞自我更新的誘導因子。Oct4和Nanog的協同作用被認為是干細胞表型的誘導因子，這在以肝細胞癌為基礎的干細胞特性研究及上皮細胞-間充質轉化（EMT）的促進作用研究中被證實[30]。

RKIP可能通過多種途徑間接介導CSC中Nanog的表達。上調Raf-1/MEK/ERK通路可誘導Nanog在Ser52位置磷酸化，提示MAPK通路可能影響與腫瘤干細胞和胚胎干細胞自我更新特性相關的通路。Oct4與Nanog之間的密切關系表現為RKIP通過2個相關途徑間接調控Oct4，從而也間接影響Nanog的表達。

RKIP的正常功能是抑制Raf-1/MEK/ERK信號級聯，但當RKIP被抑制時，ERK可以使已與Lin28啟動子結合的Myc轉錄因子磷酸化并上調其基因產物，進而激活Oct4的表達。Oct4通常與Sox2形成異源二聚體與Nanog啟動子結合，誘導Nanog表達，但由于RKIP的抑制作用，可以有效阻斷Oct4及其下游靶點Nanog的表達。

RKIP介導的Nanog調控的另一個潛在途徑來自p53，一種腫瘤抑制產物，與小鼠胚胎干細胞的Nanog啟動子的結合。當p53對DNA損傷響應時，它可能與2個一致的結合基序結合，這2個基序誘導Nanog的抑制表達以修復遺傳損傷。

4 結語

RKIP和CSC研究的下一步是尋找可能的治療方法投入臨床應用。關于CSC的假設是它們的存在支持并驅動著各種腫瘤的惡性程度。在評估與CSC表型相關的轉錄因子的普遍過表達水平后，新的治療干預可能利用多潛能相關途徑來阻止或阻礙CSC的生長。新的治療靶點可以通過抑制或下調Oct4、Sox2、KLF4或與NF-κB相關的因子的表達而發揮作用。

研究表明，Oct4和Sox2相關的干細胞樣特征與惡性腫瘤的臨床意義之間可能存在相關性。Oct4和Sox2在宮頸癌中與患者預后不良、Oct4高表達和Sox2丟失之間的相關性顯而易見[31]。然而，很難確定Sox2表達的確切結果，因為在肺癌中Sox2的高表達與患者的低生存率相關，而在食管鱗癌中Sox2的低表達與預后不良相關[32]。另一項研究發現，沉默Sox2可以挽救癌癥藥物他莫西芬的療效，他莫西芬被用作治療乳腺癌的內分泌療法。乳腺癌細胞普遍對他莫昔芬耐藥，它們表達高水平的Sox2，因此治療也變得更加困難。Sox2在耐藥腫瘤細胞中的過度表達提示Sox2參與了CSC的Wnt信號轉導[33]。通過下調Sox2的表達，Wnt信號也降低，從而使耐藥細胞對他莫昔芬重新敏感[34]。目前尚在進行的臨床試驗正在進一步研究不同治療藥物對CSC及其各自惡性腫瘤的影響。通過了解CSC相關轉錄因子在誘導多潛能和腫瘤發生中的作用，有可能選擇性地靶向這些途徑并產生治療癌癥的方法。目前尚不清楚這些療法能在多大程度上通過與CSC相關的途徑治療癌癥，還需要通過進一步的研究和臨床試驗來確定。