程序性死亡配體1的轉運與穩定性

鄒媚，林佳，王清水

福建師范大學 生命科學學院，福建 福州 350117

機體在正常情況下，免疫系統會通過相關共抑制和共刺激受體及其配體（被稱為免疫檢查點）來保護宿主免受自身免疫、過敏和傳染病的侵襲[1-2]。臨床數據表明，腫瘤利用許多類似途徑作為重要的開關來逃避抗腫瘤免疫反應，并最終發展、傳播和轉移[1,3]。在生理免疫穩態中細胞程序性死亡受體1（programmed death receptor-1，PD-1）和程序性死亡配體1（programmed death ligand-1，PD-L1）軸在免疫通路中發揮關鍵作用[4]，PDL1在黑色素瘤、卵巢癌、肺癌和腎癌細胞中的高表達是癌細胞逃避免疫系統的重要途徑[5]。腫瘤發生過程中PD-1的主要配體為PD-L1，一旦腫瘤細胞膜表面編程蛋白PD-L1高于正常組織細胞，與被激活的T細胞膜受體PD-1識別結合，傳達抑制免疫信號后，導致T淋巴細胞數量減少、T細胞活性削弱、免疫因子與免疫細胞生成及活性下調等免疫應答，從而幫助腫瘤實現免疫逃逸[6]。

PD-L1蛋白轉運調控研究進展表明，蛋白激酶D（PKD）通過誘導脂酰肌醇4激酶（PI4K）和磷脂酰肌醇4-磷酸5-激酶（PIP5K）的磷酸化來調節PD-L1的轉運[7-9]，順鉑通過誘導細胞外信號調節激酶1/2（ERK1/2）磷酸化介導膜表面蛋白PDL1的上調[10]，依賴核因子κB（NF-κB）信號通路的CD40誘導PD-L1向細胞表面轉運[11]；人類趨化因子CMTM6能與PD-L1結合并能維持其在細胞表面的穩定表達[12]；亨廷頓相互作用蛋白1相關蛋白（HIP1R）靶向PD-L1溶酶體降解，從而調控T細胞介導的腫瘤殺傷作用[13]；二甲雙胍導致PDL1翻譯后修飾異常，進而阻斷其從內質網到高爾基體的轉運[14]；PD-L1的2種不同剪接形式決定了后期在膜或胞質區的定位[15]，并且能以可溶性和外泌體的形式游離于胞外[16-17]。這些因子都可能成為潛在的腫瘤免疫治療手段。在此，我們簡要綜述PD-L1的轉運及維持穩定性的相關因素。

1 PD-1與PD-L1

PD-1擁有288個氨基酸殘基，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，作為凋亡相關分子在凋亡的免疫細胞系中被發現，主要表達于抗原性記憶T細胞，少量表達于B細胞、活化自然殺傷細胞（NK細胞）和單核細胞[18]。PD-1由胞外區免疫球蛋白超家族結構域及胞質區免疫受體酪氨酸開關基序（ITSM）和免疫受體酪氨酸抑制基序（ITIM）組成，并含有ITSM和ITIM的磷酸化位點[1,19]。PD-L1擁有290個氨基酸殘基，屬于Ⅰ型跨膜蛋白，且對T細胞有抑制作用，1999年由陳列平等發現，在腫瘤細胞中的表達高于正常組織細胞[20-21]。成熟的PD-L1包含跨膜結構域、Ig-C和Ig-V樣的胞外結構域，以及在不同物種中高度保守且不含信號肽的胞質結構域[22-23]。研究發現該蛋白以外泌體的形式大量存在于腫瘤細胞外，遠高于正常組織細胞，并能夠遠程影響機體的免疫狀態[24-25]，表明腫瘤細胞中PD-L1這一項免疫檢查點是腫瘤實現免疫逃逸的主要路線。

當腫瘤細胞膜蛋白中PD-L1與T淋巴細胞中PD-1的胞外結構域相互識別時，T細胞募集與酪氨酸蛋白激酶Src同源的磷酸酶SHP-1和SHP-2，誘導PD-1胞內結構域中的ITIM和ITSM進行磷酸化，進一步抑制T細胞受體（TCR）下游信號通路的傳導，使T淋巴細胞功能發生障礙、耗竭、凋亡和免疫中和[4,26]，生成高度浸潤的調節性T細胞（Treg）及細胞毒性T細胞（CD8+）抑制效應免疫反應，并讓機體處于腫瘤細胞殺傷抵抗現狀[14,23,27]。

2 PD-L1的轉運

2.1 蛋白的分選和轉運

傳統意義上細胞核編碼的蛋白質分選有2條轉運途徑：共翻譯轉運和后翻譯轉運[28]。共翻譯轉運途徑是當蛋白質在游離核糖體合成延伸幾十個氨基酸之后，前端信號肽與其結合的信號識別顆粒（SRP）共同引導新生肽邊合成邊轉至糙面內質網并定位于內質網，而后通過轉運膜泡將肽鏈轉移到高爾基體中進行加工、包裝，形成成熟的蛋白質后分選到溶酶體、細胞膜或以可溶性蛋白的形式分泌到胞外。后翻譯途徑是蛋白質在細胞質基質中游離的核糖體上完成多肽的合成和修飾，直接轉運至細胞內的細胞器，成為細胞質中骨架蛋白或可溶性駐留蛋白[29-30]。PD-L1屬于共翻譯轉運的過程。

2.2 調控PD-L1運輸的關鍵因素

由于PD-L1高表達于腫瘤細胞膜表面，并利用PD-1/PD-L1軸的免疫檢查點負向調控機體免疫作用[31]，因此了解影響其轉運的相關因素是必要的。Poly（I∶C）是一種可增強免疫治療的合成型dsRNA模擬物，Varthanan等發現，用Poly（I∶C）預處理樹突狀細胞（DCs）后重組 CD40（rCD40L）導致膜表面PD-L1水平增加而胞內無明顯差異，與此同時rCD40L誘導的PD-L1轉運可被NF-κB信號通路抑制劑南蛇藤醇（celastrol）抑制[11]，表明Poly（I∶C）處理DCs后，rCD40L誘導膜表面PD-L1的轉運依賴于NF-κB。有趣的是，在用蒽環類藥物阿霉素處理乳腺癌細胞時，檢測到膜表面PDL1蛋白水平明顯下調而細胞核中PD-L1上調。此過程伴隨磷酸化AKT蛋白（p-AKT）的易位，即細胞膜和細胞質中p-AKT下降，細胞核中p-AKT上升[32]，表明PD-L1重新分布到細胞核中的過程與p-AKT轉位到細胞核有關。PI3K/AKT通路的抑制作用可消除阿霉素介導的PD-L1的核上調，表明PI3K/AKT通路參與了PD-L1的核上調[32-33]。

腫瘤的微環境中，炎癥細胞分泌的γ干擾素（IFN-γ）是主要刺激腫瘤PD-L1表達的一種細胞因子。用IFN-γ處理人口腔鱗狀細胞癌會上調PKD2及膜表面PD-L1的表達，并存在時間和劑量依賴性[34]。當PKD的化學抑制劑抑制或采用shRNA/siRNA干擾PKD2，IFN-γ誘導表達效果明顯下降[34]。已有研究表明PKD介導PI4K和PIP5K的磷酸化并加強蛋白之間膜質運輸，且PI4K與PIP5K也參與調解蛋白進入特定的膜位置[7-9]，說明依賴IFN-γ的PD-L1轉運中PKD軸信號通路具有調節作用。另外，PKD阻滯劑的加入能削弱紫杉醇誘導宮頸癌細胞TC-1表面PD-L1的表達[35]，這與PKD參與IFN-γ誘導的PD-L1轉運相似。此外，二甲雙胍作為Ⅱ型糖尿病口服藥物能激活AMP依賴的蛋白激酶（AMPK），直接導致PD-L1 S195的磷酸化，誘導PD-L1異常糖基化并導致內質網相關蛋白（ERAD）降解，進而阻斷PD-L1從內質網到高爾基體的正常轉運[14]。

依托泊苷、5-氟尿嘧啶（5-Fu）、順鉑和尼美舒利等多種試劑都可調控腫瘤細胞膜表面PD-L1的表達[35-38]。據報道，順鉑通過調節ERK1/2的磷酸化來上調肝癌細胞株H22膜表面PD-L1的表達，且在其他腫瘤細胞如HNSCC和宮頸癌中發現順鉑亦能上調膜表面PD-L1的表達[10]。5-Fu處理結直腸癌細胞HCT-116可能調節PD-L1蛋白的轉運，導致膜和胞內的PD-L1表達差異[36]。相反地，尼美舒利處理乳腺癌細胞后，下調了膜表面的PD-L1蛋白表達[37]。這些試劑對腫瘤微環境中PD-L1蛋白具體轉運信號通路的作用有待進一步探究。

PD-L1不同的剪接體會影響其在細胞內的轉運和分布。在外周血單核細胞（PBMC）中發現一個PD-L1新型mRNA剪接變體，主要定位于細胞內，傳統的同工型PD-L1成熟后主要表達于血漿表面，2種剪接變體有明確的定位模式[15]。證明了PD-L1蛋白結構中Ig-V結構域對于靶向細胞表面的轉運至關重要。

2.3 PD-L1的亞細胞轉運

對于腫瘤細胞而言，治療難點在于PD-L1可以源源不斷地從細胞中產生，最近研究表明，大量PD-L1以外泌體和可溶性蛋白形式存在[16-17]。外泌體在多種腫瘤細胞胞外具有豐富的生物活性，提示外泌體可能成為半侵襲性生物標志。在前列腺癌模型中，外泌體PD-L1具有抑制抗腫瘤免疫反應系統的作用，其阻滯促進引流淋巴結T細胞的活性，誘導全身抗腫瘤免疫和記憶[25]。值得注意的是，胞外囊泡可以攜帶活性PD-L1分泌到胞外，協助腫瘤的免疫逃逸，免受PD-L1抑制劑的追殺。Zhou等在黑色素瘤模型中鑒定出4個缺少跨膜結構域的可溶分泌型PD-L1剪接體，可溶性PD-L1中大部分能夠抑制免疫T細胞的活性，在藥物刺激誘導下能夠促進表達[39]。在結合單抗PD-L1耐藥治療試驗中檢測到PD-L1的2個剪接變體v229/v242能夠競爭性結合抗體并有效中和抗體活性[24]。這些結果有力地說明了腫瘤聰明地躲開了很多治療方法。蛋白水平的定量分析只提供了復雜的轉運調控中的一個契點，尋找新型有效阻斷PD-L1蛋白轉運的相關試劑仍然具有重大意義。

3 PD-L1的穩定性

研究表明，除了蛋白的糖基化和泛素化修飾外，PD-L1結合蛋白也會影響PD-L1的穩定性[40]。最近被鑒定為PD-L1正調控因子的CMTM6是一種Ⅲ型跨膜蛋白，通過輔助性伴侶蛋白STUB1阻止PD-L1的多聚泛素化，與PD-L1共定位以競爭性回收至內體，防止溶酶體導致PD-L1降解，提高PD-L1在細胞內的穩定性[41]。CMTM4具有與CMTM6相似的功能[12]。Sigmal是另一種能與PDL1結合的蛋白，它是某種特定配體調控的完整支架蛋白，用以維持細胞蛋白與脂質的穩定，故其小分子抑制劑能夠通過選擇性自噬誘導PD-L1降解抑制乳腺癌和前列腺癌細胞[42]。

PD-L1蛋白降解的具體調控機制仍不清楚，而后發現的HIP1R揭示了PD-L1溶酶體降解途徑的相關機制。HIP1R是參與囊泡運輸的F-肌動蛋白和網格蛋白的結合蛋白，在多種腫瘤細胞中敲低HIP1R均表現為上調PD-L1表達。其作為PD-L1溶酶體降解的負性調控分子，依賴于HIP1R中的PD-L1結合序列和分選序列，能通過與AP復合物結合將PD-L1運輸到溶酶體表面，內吞體分選轉運復合體（ESCRT）相關蛋白ALIX作用后將PD-L1運輸至多囊體和溶酶體中進行降解。經驗證，融合了結合序列和分選序列的多肽PD-LYLSO可以有效介導靶標蛋白PD-L1的降解[13]。蛋白酶體抑制劑MG132[43]和溶酶體抑制劑氯喹[44]都可增加PD-L1蛋白的表達，說明PD-L1的降解途徑包括蛋白酶體降解和溶酶體降解。迄今仍不清楚在不同的癌癥中哪種途徑占優勢。

4 結語

癌癥細胞中PD-L1的轉運通路還未明晰，但我們知道它不僅存在于腫瘤細胞表面，還存在于高爾基體、循環內體和微囊泡中，胞內也不斷地為胞外PD-L1進行補充，都能行使正常的促癌生物功能。這或許是造成目前抗體藥物對不同癌癥療效受限甚至耐藥的原因。如果能確定PD-L1活性變構并挑選與PD-L1相互作用的蛋白質，如CMTM4/6、Sigmal和HIP1R等表征后進行充分的蛋白分析，可開發合理的阻斷肽或化合物設計，與PD-L1/PD-1單抗藥物雙結合共同治療癌癥，不失為一種新的治療手段。目前發現有效而具體地靶向癌細胞的PD-L1仍然是一個棘手的問題。