P-糖蛋白相關(guān)信號通路介導(dǎo)腫瘤細胞多藥耐藥機制的研究進展

劉亨晶，魏敏，孫瑾瑜，于曉輝，張久聰

1.解放軍聯(lián)勤保障部隊第九四〇醫(yī)院 消化內(nèi)科，甘肅 蘭州 730050；2.甘肅中醫(yī)藥大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州 730000

多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）是腫瘤細胞免受化療藥物攻擊最重要的防御機制，也是導(dǎo)致腫瘤化療療效降低或失敗的主要原因之一。腫瘤細胞產(chǎn)生多藥耐藥的機制十分復(fù)雜，主要是通過上調(diào)一個或多個ABC細胞膜轉(zhuǎn)運體，將腫瘤細胞內(nèi)的化療藥物排出細胞外，使細胞內(nèi)藥物濃度降低實現(xiàn)的。P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）是具有典型特征的ABC細胞膜轉(zhuǎn)運體之一，在具有耐藥表型的腫瘤細胞中過度表達。目前研究表明，P-gp表達受多種信號通路調(diào)控，如核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）、磷脂酰肌醇 3-激酶/蛋白激酶 B（phosphatidylinositol-3-kinase/protein kinase B，PI3K/AKT）信號通路等。本文將對P-gp相關(guān)信號通路介導(dǎo)腫瘤細胞多要耐藥的機制進行綜述。

1 P-gp的基本結(jié)構(gòu)、分布及功能

P-gp是在耐藥細胞中發(fā)現(xiàn)的一種由1280個氨基酸殘基組成的單鏈異二聚體膜蛋白[1]。P-gp由MDR1基因（ABCB1）編碼，位于人7號染色體上，相對分子質(zhì)量為170 000。P-gp由2個半轉(zhuǎn)運體組成，每個轉(zhuǎn)運體擁有2個跨膜結(jié)合域和2個核苷酸結(jié)合域，包含6個轉(zhuǎn)運膜區(qū)和1個ATP結(jié)合利用區(qū)的部分構(gòu)成，跨膜結(jié)合域與底物的跨膜轉(zhuǎn)運有關(guān)，而核苷酸結(jié)合域能與ATP結(jié)合為底物轉(zhuǎn)運提供能量[2]。

P-gp在人體中分布廣泛，在腸、肝、腎、腦、睪丸、胎盤和眼睛等有分泌功能和排泄功能的上皮細胞膜上表達量相對較高，在人體重要屏障如血腦屏障、血睪屏障、胎盤和血-視網(wǎng)膜屏障的內(nèi)皮細胞上也有分布[3]，可保護正常細胞及組織免受毒性物質(zhì)的損害。P-gp的底物范圍比較廣泛，能夠識別與轉(zhuǎn)運一系列結(jié)構(gòu)多樣的重要內(nèi)源性物質(zhì)（如白三烯和雌激素結(jié)合物）和外源性物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物，包括多種化療藥物[4]?；赑-gp的結(jié)構(gòu)和功能，其跨膜轉(zhuǎn)運機制被廣泛認(rèn)為是P-gp分別與底物及2個ATP分子結(jié)合后，其中一個ATP分子發(fā)生水解引起底物結(jié)合位點構(gòu)象的改變，進而導(dǎo)致跨膜結(jié)合域與底物之間親和力急劇下降并釋放、排出藥物，從而導(dǎo)致耐藥[5]。

2 PI3K/AKT信號通路對P-gp的調(diào)控機制

PI3K/AKT信號通路是細胞外生存和生長的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，研究發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT信號通路在多發(fā)性骨髓瘤、胃癌、肝細胞癌、乳腺癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤中可過度激活，尤其在耐藥的腫瘤細胞中高表達或過表達。PI3K由調(diào)節(jié)亞基（p85）和催化亞基（p110）組成，異二聚體p85/p110從細胞質(zhì)移動到細胞膜上后磷酸化，AKT活化后可激活其下游雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）、糖原合成酶激酶-3（glycogen synthase kinase-3，GSK-3）、NF-κB 激酶抑制劑（inhibitor of nuclear factor κB kinase，IκB）、PTEN 等，調(diào)控耐藥基因 MDR1的表達。Dong等[6]研究發(fā)現(xiàn)AKT特異性抑制劑MK-2206通過下調(diào)p-AKT、P-gp的表達水平，逆轉(zhuǎn)MDR，結(jié)果表明PI3K/AKT信號通路的激活可上調(diào)P-gp的表達，介導(dǎo)肝癌細胞對索拉非尼的耐藥。Liu等[7]發(fā)現(xiàn)PD-L1在多種腫瘤中表達上調(diào)，與PD-1相互作用后可激活PI3K/AKT，反向上調(diào)MDR1/P-gp的表達，導(dǎo)致乳腺癌細胞的MDR。知母皂苷A-Ⅲ、康萊特、苦參堿等多種藥物可通過抑制PI3K/AKT信號通路在一定程度上逆轉(zhuǎn)MDR，然而由于多條信號通路之間存在交叉，對P-gp的調(diào)節(jié)機制更加復(fù)雜，因此對于逆轉(zhuǎn)劑的研發(fā)更加困難，可在現(xiàn)有藥物的基礎(chǔ)上進行深入研究。

3 MAPK信號通路對P-gp的調(diào)控機制

在腫瘤發(fā)生過程中，MAPK信號級聯(lián)可被多種機制組成性地激活，在各種刺激信號調(diào)節(jié)P-gp表達介導(dǎo)MDR發(fā)生過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。MAPK信號通路主要由細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）、c-Jun N端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和p38 MAPK組成。

ERK1/2在細胞增殖、分化、黏附、遷移等中發(fā)揮重要作用。大量研究表明ERK1/2的過度激活與腫瘤細胞對化療的耐藥性呈正相關(guān)，活化的ERK1/2進入細胞核后可直接激活許多轉(zhuǎn)錄因子，如ETS-1、AP-1（c-Jun或c-Fos）和c-Myc，進而促進MDR1的表達，上調(diào)P-gp，參與乳腺癌、肝癌等細胞MDR的發(fā)生。Ji等[8]研究發(fā)現(xiàn)，胃癌間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）外泌體中MDR1/P-gp的表達增加會導(dǎo)致鈣離子進入胃癌細胞內(nèi)，形成鈣/鈣調(diào)素復(fù)合物，激活鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶（calcium/calmodulin-dependent protein kinases，CaM-Ks）。CaM-Ks的激活可以活化其下游的Raf/MEK/ERK激酶級聯(lián)，從而使MDR1的表達上調(diào)，介導(dǎo)MDR的產(chǎn)生，而CaM-Ks磷酸化抑制劑KN-93可以抑制CaM-Ks活化、MDR1的表達。因此，胃癌細胞MSCs外泌體是通過蛋白質(zhì)激活CaM-Ks/Raf/MEK/ERK信號級聯(lián)，而不是直接將MDR相關(guān)蛋白或mRNA轉(zhuǎn)移到細胞內(nèi)參與MDR。另一項研究發(fā)現(xiàn)在順鉑耐藥的宮頸腺癌HeLa細胞中ERK1/2的磷酸化水平降低，P-gp的表達上調(diào)[9]，這與目前的多數(shù)研究結(jié)果相反。綜上，ERK1/2信號通路在調(diào)控P-gp的表達，介導(dǎo)腫瘤細胞MDR發(fā)生過程中發(fā)揮了重要作用，抑制ERK1/2可在一定程度上逆轉(zhuǎn)MDR，但是其表達在不同的耐藥腫瘤細胞中可能呈現(xiàn)相反的水平，具體機制有待進一步研究。

JNK信號通路可以被細胞因子、毒素、藥物和代謝變化等多種刺激激活，參與細胞分化、凋亡和應(yīng)激反應(yīng)，越來越多的證據(jù)表明JNK與MDR的發(fā)生密切相關(guān)。在5-氟尿嘧啶耐藥的人肝癌細胞中，JNK信號通路的激活導(dǎo)致與MDR1基因啟動子區(qū)結(jié)合的c-Jun表達上調(diào)，而c-Jun是JNK的代表性靶點，可以與c-JunB二聚形成轉(zhuǎn)錄因子AP-1，促進MDR1的表達[10]。在順鉑誘導(dǎo)HepG2耐藥后，發(fā)現(xiàn)P-gp表達上調(diào)，JNK1/2磷酸化增加，用JNK信號通路抑制劑SP600125可通過下調(diào)P-gp的表達增強肝癌細胞對順鉑的敏感性[11]。同樣，在阿霉素耐藥的胃癌細胞和長春新堿耐藥的人結(jié)腸癌細胞中也有類似的報道。相反，生脈注射液[12]、鹽酸千金藤堿[13]、抗腫瘤藥物桑根的提取物可通過激活JNK通路，使其下游底物Jun磷酸化水平增加，使耐藥基因MDR1的表達降低，在一定程度上逆轉(zhuǎn)了胃癌細胞的MDR。Liu等[14]發(fā)現(xiàn)在常氧狀態(tài)下，JNK途徑激活后增加了c-Jun和MDR1啟動子中AP-1位點的結(jié)合，抑制了人小細胞肺癌細胞耐藥基因MDR1的表達，而在缺氧狀態(tài)下，JNK途徑激活可誘導(dǎo)低氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）轉(zhuǎn)移到核內(nèi)后與HIF-1發(fā)生二聚反應(yīng)，進而與MDR1啟動子中的低氧反應(yīng)元件結(jié)合，使MDR1的轉(zhuǎn)錄增加。綜上，JNK信號通路在腫瘤細胞的MDR中可能起著雙重作用，這可能與腫瘤類型、凋亡刺激特性、腫瘤微環(huán)境和其他信號通路的參與有關(guān)，故對于JNK信號通路在MDR過程中發(fā)揮的作用須進行更深入的研究。

p38 MAPK是典型的蘇氨酸（Thr）和酪氨酸（Tyr）磷酸化激活蛋白，MAPKKs對Thr和Tyr的雙重磷酸化可激活p38 MAPK，然后激活其下游的多個MDR1基因轉(zhuǎn)錄因子如YB-1、AP-1等，調(diào)節(jié)P-gp的表達，從而介導(dǎo)MDR的發(fā)生。NF-κB是p38 MAPK下游重要的轉(zhuǎn)錄因子，激活后也可調(diào)節(jié)P-gp的表達。Luo等[15]報道p38 MAPK激活引起的NF-κB易位可使慢性粒細胞白血病細胞MDR1的過表達和對伊馬替尼耐藥性的增加，白藜蘆醇能顯著抑制阿霉素耐藥的骨肉瘤細胞中p38 MAPK（磷酸化）和p65（乙酰化）的表達水平，使MDR1和P-gp的表達下調(diào)，逆轉(zhuǎn)骨肉瘤細胞的阿霉素耐藥[16]。積雪草酸可通過抑制ERK1/2、AKT、p38 MAPK和JNK的磷酸化降低，阻斷YB-1的核轉(zhuǎn)位而導(dǎo)致P-gp表達水平降低[17]。這些結(jié)果均提示在p38 MAPK信號通路激活的同時，其他信號通路也可能被激活共同參與腫瘤細胞MDR的發(fā)生，因此，可聯(lián)合使用信號通路的特異性抑制劑來逆轉(zhuǎn)MDR，但要注意的是聯(lián)合治療是否會影響細胞正常的生理功能。除上述機制外，p38 MAPK誘導(dǎo)的細胞外刺激，如氧化應(yīng)激、低滲、紫外線照射和缺氧等，與腫瘤細胞的MDR有一定關(guān)系[18]，調(diào)控p38 MAPK信號通路的活性可能會改善腫瘤微環(huán)境，進而逆轉(zhuǎn)MDR。

4 NF-κB信號通路對P-gp的調(diào)控機制

NF-κB是一個普遍存在的轉(zhuǎn)錄因子家族，可被細胞因子或DNA損傷劑，如化療藥物等刺激激活。在肝癌、大腸癌等腫瘤細胞中，NF-κB通過銜接蛋白向信號分子NF-κB激酶（IKKs）傳遞信號，導(dǎo)致IKKs磷酸化，抑制蛋白IkBα降解，p50/p65核轉(zhuǎn)移，進而使NF-κB信號通路活化，調(diào)節(jié)耐藥基因MDR1的表達水平。Sun等[19]通過計算機序列分析及免疫共沉淀對其分子機制進一步研究，發(fā)現(xiàn)MDR1啟動子區(qū)域存在NF-κB的結(jié)合位點（2324～2315處的GAAATTTCC），NF-kB激活后可能直接與MDR1基因啟動子結(jié)合，使P-gp過表達，導(dǎo)致MDR的產(chǎn)生。

Chen等[20]發(fā)現(xiàn)NF-κB在細胞中的持續(xù)激活可導(dǎo)致抗凋亡蛋白BCL-2上調(diào)，BCL-2通過反饋機制下調(diào)IκBα的表達，進一步增強NF-κB的激活與MDR1的啟動子結(jié)合，激活MDR1的轉(zhuǎn)錄并上調(diào)P-gp的表達，抑制細胞凋亡，介導(dǎo)MDR的產(chǎn)生。反之，用NF-κB特異性抑制劑、siRNA技術(shù)靶向干預(yù)NF-κB基因后MDRl、P-gp明顯下降，導(dǎo)致腫瘤細胞凋亡增加[21]。綜上，MDR的發(fā)生是一個由信號通路及凋亡和耐藥基因組成的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)共同調(diào)控的，抑制或siRNA技術(shù)靶向干預(yù)NF-κB信號通路是逆轉(zhuǎn)MDR的重要靶點。

5 其他信號通路對P-gp的調(diào)控

除上述經(jīng)典的信號通路外，其他信號通路也可以調(diào)控P-gp的表達介導(dǎo)MDR。Liu等[22]研究發(fā)現(xiàn)長非編碼RNA CCAL可激活Wnt/β-catenin信號通路，抑制AP-2α，進而上調(diào)MDR1/P-gp的表達，誘導(dǎo)大腸癌細胞產(chǎn)生MDR。Wnt/β-catenin信號通路激活也可調(diào)控乳腺癌、卵巢癌、神經(jīng)母細胞瘤細胞中P-gp的表達介導(dǎo)MDR。Jeddi等[23]研究發(fā)現(xiàn)MDR1的啟動子包含核因子E2相關(guān)因子（NF-E2-related factor 2，Nrf2）的結(jié)合位點，胃癌細胞中Nrf2過表達使下游基因MDR1表達上調(diào)，導(dǎo)致P-gp外排作用增強。STAT3信號通路抑制后可以逆轉(zhuǎn)胃癌、乳腺癌、肝癌等細胞的MDR。上述信號通路調(diào)控P-gp參與MDR的相關(guān)研究相對較少，可能是目前尚未引起重視，但其在MDR發(fā)生過程中的作用不容忽視，應(yīng)該進行深入的研究，可能為逆轉(zhuǎn)MDR提供重要的治療靶點。

6 結(jié)語

MDR是影響腫瘤化療療效的主要因素之一，ABC細胞膜轉(zhuǎn)運蛋白P-gp的過表達可降低細胞內(nèi)化療藥物的濃度，介導(dǎo)MDR發(fā)生。近年來越來越多的研究發(fā)現(xiàn)P-gp的表達受到一個或多個信號通路的調(diào)控。因此，了解P-gp相關(guān)信號通路介導(dǎo)MDR的機制可能為逆轉(zhuǎn)MDR提供潛在的靶點，為研發(fā)療效顯著的化療藥物提供臨床思路，進而提高惡性腫瘤化療療效，改善疾病預(yù)后及提高患者的生存質(zhì)量。