近紅外光譜法測定頭孢曲松鈉含量

馮麗雄，彭 鶯，吳偉東，萬恒興

(深圳技師學院 應用生物系，廣東 深圳 518116)

頭孢曲松鈉是第三代半合成頭孢菌素類抗生素，其抗菌譜廣，抗菌原理是通過抑制細菌的細胞壁合成，對革蘭氏陽性及陰性菌均有中等強度的抗菌作用[1]，在臨床中廣泛應用[2-4]。測定頭孢曲松鈉的含量的方法主要是高效液相色譜法，但高效液相色譜法檢測樣品制備和操作步驟復雜[5-7]，檢驗時間長，試劑耗材成本高，環境污染大，是現代企業面臨需要解決的問題。

近年來，在分析領域里發展迅速的近紅外光譜(Near-infrared Spectroscopy，簡稱NIR)分析技術，具有測量速度快、測試成本低、無需化學試劑、樣品無需預加工等優點[8-9]，在化工、制藥等許多領域具有廣闊的應用前景[10]。NIR技術已成功應用于測定注射用頭孢派酮鈉[11]、注射用頭孢他啶[12]和注射用五水頭孢唑林鈉[13]含量近紅外定量模型的報道。本文對建立的模型進行驗證并將該方法應用于頭孢曲松鈉原料及成品的含量測定。

1 儀器和樣品

1.1 儀器

瑞士萬通NIRS XDS Rapid Liquid Analyzer近紅外光譜分析儀，配單色儀400 nm至2500 nm的波長；石英比色皿厚度1 mm，數據收集和處理等通過Vision軟件完成。美國Waters高效液相色譜儀，e2695四元梯度洗脫系統，2489雙波長紫外檢測器，Waters柱溫箱，Empower2色譜工作站軟件，色譜柱為島津 ODS-3 C18(150*4.6 mm,5 μm)。XP205分析天平(感量：0.00001 g，瑞士Mettler Toledo),瑞士Mettler Toledo S20 pH計。

1.2 樣品

頭孢曲松鈉工作對照品(國藥集團致君(深圳)制藥有限公司，批號：180601)；頭孢曲松反式異構體對照品(中國藥品生物制品檢定所，批號：130660-201702)；頭孢曲松鈉原料由珠海麗珠藥業有限公司和齊魯安替制藥有限公司生產(共25批)；注射用頭孢曲松鈉成品(國藥集團致君(深圳)制藥有限公司生產共25批)。

2 方法和結果

2.1 標準溶液及供試品溶液配制

標準溶液配制方法：分別精密稱取含頭孢曲松鈉工作對照品2、1.75、1.5、1.25、1、0.75、0.5、0.25、0.1 g置10 mL 容量瓶中，用純化水溶解并定容至刻度，制成 200、175、150、125、100、75、50、25、10 mg，制成-1 的頭孢曲松鈉標準溶液。

供試品溶液配制方法：精密稱取頭孢曲松鈉1 g，置于10 mL容量瓶中，用純化水溶解并定容至刻度，制得100 mg制得水-1 溶液。

2.2 光譜掃描

儀器預熱30 min，并進行性能測和波長確認，通過測試后方可檢測。光譜范圍400～2500 nm，分辨率8.75 nm，掃描次數32 次，掃描平衡時間5 s，平衡溫度30℃。

2.3 模型建立及參數選擇

圖1 對照溶液(100 mg·mL-1)近紅外光譜二階導迭加圖Fig.1 The overlap spectra of reference solutions (100 mg·mL-1)NIR second derivative

圖2 對照溶液(100 mg·mL-1)近紅外透射光譜圖Fig.2 The initial NIR transmission spectrum of reference solutions(100 mg·mL-1)

通過近紅外光譜儀采集16個含頭孢曲松100 mg0孢曲-1 的對照溶液，比對二階導迭加圖，其中：在420～1400 nm和1500～1800 nm兩個區域重疊吻合度高(見圖1)，具有較好的穩定性，但在500～900 nm波段范圍內吸收值低(接近-0.010)(見圖2)，故對波段420～500 nm和900～1800 nm進行變量篩選。定量模型的評價可以通過內部驗證和外部驗證來評估，內部驗證主要通過“留一法”交叉驗證[14]來評價模型的穩定性及預測能力。相關系數(Corr.Coeff.)，預測殘差平方和(PRESS)，校正均方差(RMSEC)和預測均方差(RMSEP)作為評價指標對選擇的波段模型進行評估。相關系數R2的值介于0～1之間，值越大擬合性越好，RMSEC和RMSEP用于衡量預測值和測量值之間的平均偏差，數值越小說明模型的穩健性越好，PRESS越小預測能力越好[15]。建模過程中通過考察預測殘差平方和(PRESS)確定主因子數(Factor)，PRESS值越小，模型的預測能力越好[16]。本實驗通過人工選擇不同光譜區域建立定量模型，結果見表1所示。在1600～1700 nm和1700～1800 nm波段，相關系數分別為0.9997和0.9993，表明這兩個波段的模型擬合性高；校正均方差、預測殘差平方和數值均是最小的，分別是為0.2725、0.4903和0.3682、0.6362，表明這兩個波段模型的穩健性好，故選擇1600～1800 nm波段進行建模。當主因子數是5時，PRESS值3.5291最小，見圖3，故選擇最優因子數5；頭孢曲松鈉對照溶液在10～200 mg0對照-1范圍內與計算濃度相關系數接近1(R2=0.9999)，見圖4；RMSEC(校正均方差)與RMSEP(預測均方差)數值接近，表明該模型具有較好的穩定性。

表1 光譜區域對建模結果的影響Table 1 Influence of spectral range on the results of the model

圖3 主因子數和預測殘差平方和關系
Fig.3 Correlation of the principal factors numberto the PRESS

圖4 對照溶液濃度和計算濃度相關性(10～200 mg0液濃-1)
Fig.4 Correlation of calculated values to reference values (10～200 mg·mL-1)

2.4 定量模型的檢驗

采用外部驗證的方法對模型的實際預測能力進行評估，即用定量模型近紅外光譜法測試頭孢曲松鈉樣品(原料及成品各25批)結果與高效液相色譜法[17-18]測定的結果進行比較，計算近紅外光譜法(C)與高效液相色譜法(M)的偏差(%)=(C-M)/MM差(相%。結果見表 2，偏差在-1.64%～1.78%內，平均相對偏差0.87%。配對t檢驗表明，在α=0.05 顯著性水平上，兩者無顯著性差異。證明近紅外光譜法可以用于快速預測頭孢曲松鈉含量。

表2 頭孢曲松鈉近紅外光譜PLS和HPLC 法測定結果比較Table 2 Comparison of the ceftriaxone content by NIRS PLS and HPLC

2.5 精密度實驗

取頭孢曲松鈉原料(批號：QS21804090)，分別制成含頭孢曲松濃度為 200、175、150、125、100、75、50、25、10 mg為含頭-1的溶液，連續5次取樣并測定其近紅外光譜，代入模型，用 PLS 法計算樣品的含量。5次平行測定的含量 RSD 結果分別為0.05%、0.06%、0.10%、0.06%、0.07%、0.19%、0.34%、0.53%和1.83%，表明精密度良好。

3 討論

本實驗首先對頭孢曲松鈉溶液近紅外光譜，最終選擇1600～1800 nm(C-H鍵一級伸縮振動一級倍頻峰吸收區)波段，采用偏最小二乘法建立近紅外定量分析模型。因為水溶液中的液態水分子締合，吸收帶的細節帶消失，形成了較寬的譜帶[19]。水分子O-H 伸縮振動的一級倍頻在約1440 nm，合頻在 1940 nm附近有較強的吸收，在建模需避開這兩個波段。

本文建立的近紅外偏最小二乘法定量模型，對照溶液濃度在10～200 mg0液濃-1范圍內相關系數良好(0.9999)。通過高效液相色譜法進行外部驗證實驗比較，近紅外偏最小二乘法定量模型與高效液相色譜法檢測的結果基本一致，但在精密度實驗中發現測試低濃度溶液(10 mg精密度-1，RSD=1.83%)和高濃度的溶液(200 mg0濃度-1，RSD=0.05%)RSD有差異，高濃度溶液精密度更好。

頭孢曲松鈉含量測定近紅外光譜法與高效液相色譜法相比，近紅外光譜法檢測無需對照品和特殊試劑,現場快速測定，可以減少企業檢驗成本，是一種環境友好型分析測試方法。