菊花黃酮化合物組成、抗氧化活性及相關性分析

雷康藤，龍娟娟，楊琳妹，張毛毛，鈕谷雨，張 培

(滁州學院 材料與化學工程學院，安徽 滁州 239000)

菊花為菊科植物菊Chrysanthemum morifolium Ramat.的干燥頭狀花序，氣清香，味甘、微苦。具有散風清熱，平肝明目，清熱解毒之功效。按照產地和加工方式的不同，具有“亳菊”、“滁菊”、“貢菊”、“杭菊”、“懷菊”等多種類型[1]。

黃酮類化合物是菊花的主要有效成分之一，具有廣泛的藥理活性，如抗氧化活性、抗腫瘤活性等[2]。目前，國內外對菊花的研究主要集中在黃酮類化合物的提取、含量測定及初步活性研究，而作為黃酮類化合物重要特性的各黃酮種類及其含量與活性間的相關性研究鮮有報道[3-4]。此外，目前對菊花黃酮類化合物的研究通常是對某產地單一品種菊花開展獨立研究，鮮見將不同產地、不同品種菊花進行系列研究與比較的報道，故難以發現其中的規律及黃酮類化合物產生功效的作用機制。

基于此，收集來自六個不同產地的菊花，提取黃酮類化合物，測其總黃酮含量，采用HPLC法分析各黃酮類化合物種類及含量，采用DPPH法測其清除自由基能力，以偏最小二乘法(PLS)分析不同菊花中黃酮類化合物成分與清除DPPH自由基間的相關性，探究各黃酮類化合物對體外抗氧化活性間的影響，以期為不同產地菊花中黃酮類化合物功效評價及黃酮類化合物與體外抗氧化活性間的關系提供理論支持。

1 實驗試劑與儀器

無水乙醇(無錫市展望化工有限公司)； DPPH(合肥博美生物科技有限責任公司)；黃芩苷(PS010446)、槲皮素(PS010461)、芹菜素(PS010177)對照品均購于成都普思生物科技有限公司；綠原酸(110753-201817)、蘆丁(100080-201811)對照品均購于中國食品藥品檢定研究院。菊泰滁菊1號樣品、菊泰滁菊2號樣品、杭白菊、亳菊、福建胎菊、河南胎菊均購于滁州百姓緣大藥房。

分析天平(賽多利斯科學儀器(北京)有限公司)；Cary 100 Scan 紫外可見分光光度計(美國Varian公司)；高效液相色譜儀(Agilent 1200型)。

2 結果與討論

2.1 不同產地菊花中黃酮化合物的提取

分別稱取10 g左右六種干燥菊花(杭白菊，亳菊，福建胎菊，河南胎菊，滁菊1號，滁菊2號)加入100 mL 70% 乙醇溶液，于60℃加熱回流提取2次，每次2 h，合并兩次提取液。于50℃旋蒸至無液體旋出。加入20 mL去離子水混懸，加石油醚進行萃取，濃縮，低溫干燥，稱重，計算提取率。

菊泰滁菊1、菊泰滁菊2、河南胎菊、亳菊、杭白菊、福建胎菊的黃酮化合物的提取率分別為33.89%、35.54%、21.44%、36.09%、32.72%和18.06%。六種菊花中，亳菊的黃酮的提取率最高，福建胎菊最低。

2.2 不同產地菊花黃酮化合物總黃酮含量測定

2.2.1 標準曲線繪制

準確稱取0.0200 g蘆丁，60%乙醇定容于50 mL容量瓶中，搖勻，即得0.4 mg/mL蘆丁對照液；從對照液中準確移取0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00 mL分別置于7個25 mL容量瓶中；將每個容量瓶用60%乙醇迅速補加至6 mL；向各容量瓶中分別加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，放置6 min后，加入1 mL 10%的硝酸鋁，放置6 min后加入10 mL 4%氫氧化鈉，用60%的乙醇溶液定容至刻度，搖勻，放置15 min；于503 nm處測定吸光度，根據蘆丁對照品濃度和吸光度的關系繪制標準曲線。Y=10.48X-0.002(X:mg/mL，R=0.9990)，線性范圍為0.016～0.096 mg/mL。

2.2.2 樣品總黃酮含量的測定

稱0.5 g左右各菊花黃酮類化合物提取物用60%乙醇溶液溶解，定容至10 mL。精密移取0.10 mL樣品溶液于25 mL容量瓶中，用60%乙醇補加至6 mL。其它操作按“標準曲線繪制”步驟進行，測其吸光度，代入標準曲線，計算菊泰滁菊1、菊泰滁菊2、河南胎菊、亳菊、杭白菊、福建胎菊的黃酮化合物的總黃酮含量分別為12.50%、11.74%、9.47%、18.66%、23.05%和30.30%。六種菊花中，總黃酮含量最高的福建胎菊，最低的是河南胎菊。

2.3 不同產地菊花黃酮化合物種類及含量測定

2.3.1 色譜條件[5-6]

使用 Agilent 1200型高效液相色譜儀進行分析。色譜柱：依利特sinopak C18(4.6 mm×250 mm，5 L)；流動相：甲醇-0.2%乙酸(65∶35)，流速：1.0 mL/min，檢測波長：320 nm，柱溫: 25 ℃；進樣量：10 μL。

2.3.2 混合對照品溶液和供試品溶液的制備

精密稱取黃芩苷5.2 mg，槲皮素5.2 mg，綠原酸5.2 mg，芹菜素5.3 mg，蘆丁5.2 mg，加甲醇溶解并定容于10 mL，制得混合對照品溶液。

精密稱定各菊花黃酮類化合物提取物適量，加甲醇溶解并定容于25 mL，得供試品溶液。

2.3.3 線性關系考察

精密移取各混合對照品溶液0.10、0.20、0.40、0.60、1.20、2.4 mL至5 mL容量瓶中，用甲醇定容，得不同濃度的混合對照品溶液，分別注入液相色譜儀，得色譜圖，如圖1A所示，每種黃酮類化合物在色譜中均為單峰。以各黃酮對照品濃度為橫坐標( X：mg/mL)，以峰面積(Y)為縱坐標，做回歸方程，結果如表1所示。

圖1 黃酮混合對照品(A)和菊花中黃酮化合物樣品(B)HPLC圖
Fig.1 HPLC chromatograms of mixture standards (A) and Chrysanthemum (B)

表1 各黃酮化合物線性關系及檢出限Table 1 Regression equations,linear range and LODs of the five investigated compounds

2.3.4 精密度、重復性、穩定性試驗

取同一混合標準品溶液，按“2.3”項下“色譜條件”連續重復進樣測定6 次，計算得黃芩苷、槲皮素、綠原酸、芹菜素、蘆丁的峰面積 RSD 分別為3.16%、1.56%、0.65%、3.45%、1.80%，表明儀器精密度較好。

取同一菊花供試品，按“2.3”項下“色譜條件”連續重復進樣測定6 次，計算得黃芩苷、槲皮素、綠原酸、芹菜素、蘆丁的峰面積 RSD 分別為2.55%、0.99%、0.53%、2.62%、0.83%，表明方法重復性較好。

對照品溶液置于 4℃ 冰箱中，分別在 0、12、24 h 后，按“2.3”項下“色譜條件”測定。經測定得到綠原酸、蘆丁、黃芩苷、槲皮素、芹菜素的峰面積的RSD 依次為1.94%、1.94%、3.93%、4.01%、3.44%，說明對照品溶液在 24 h 內穩定性良好。

2.3.5 含量測定

取各供試品溶液，分別按“2.3”項下“色譜條件”進樣，色譜圖如圖1B所示。記錄各峰面積，代入相應標準曲線，計算六種菊花樣品中黃芩苷、槲皮素、綠原酸、芹菜素、蘆丁的含量測定結果見表2。從表2可以看出,在不同來源的菊花樣本中5種成分含量有明顯的差異,其中綠原酸含量變異范圍較大。根據中國藥典要求，菊花中綠原酸的含量不應低于0.2%[1]，本實驗中六種菊花的綠原酸含量均高于0.63%，符合藥典要求。

表2 各菊花中黃酮化合物含量測定結果 %Table 2 Content determination results of flavonoids in different Chrysanthemums

2.4 不同產地菊花黃酮化合物DPPH自由基清除能力測定[7]

分別準確稱取各產地菊花黃酮化合物3.0 mg，加入60%乙醇溶解并定容至25 mL，得樣品溶液。分別取1.5 mL各黃酮化合物樣品溶液于試管中，加入4.5 mL DPPH(0.1045 mmol/L)溶液，室溫避光反應30 min，以無水乙醇作為空白實驗，在517 nm波長處分別測定吸光度。按下式分別計算DPPH自由基清除率。平行實驗3次。

自由基清除率=[A0-(As-Ac)]/A0

式中：A0為1.5 mL蒸餾水+4.5 mL DPPH溶液的吸光度；As為1.5 mL樣品溶液+4.5 mL DPPH溶液的吸光度；Ac為1.5mL樣品溶液+4.5 mL無水乙醇的吸光度。

測定不同產地菊花黃酮化合物對DPPH自由基的清除能力并以抗壞血酸作陽性對照，結果見圖2。由圖可知不同產地菊花黃酮化合物對DPPH自由基的清除率不同，福建胎菊DPPH自由基清除率相對較高，為73.03%，杭白菊和亳菊DPPH自由基清除率都在50%以上，河南胎菊DPPH自由基清除率為43.65%，來自同一地區的滁菊1號樣品和滁菊2號樣品的DPPH自由基的清除率相差不大，分別為：39.51%，36.88%，相對較低。

圖2 各菊花中黃酮化合物對DPPH自由基的清除率Fig.2 The antioxidant activities against DPPH radicals of flavonoids in different Chrysanthemums

2.5 相關性分析

由表2 及圖1可知，菊花黃酮主要由綠原酸、黃芩苷、蘆丁、芹菜素、槲皮素組成，但不同產地的菊花黃酮，其成分的量及對抗氧化活性均有所不同。為明確每種成分及量與抗氧化活性間是否有關聯，利用Simca-p 11.5軟件采用PLS分析法對菊花黃酮的成分種類及量與其對抗氧化活性進行相關性分析，探討兩者的關系。以菊花黃酮成分組成為獨立變量(X)，以菊花黃酮成分對抗氧化活性的抑制率作為因變量(Y)，采用PLS進行相關性分析，得到各成分的回歸系數。其中系數絕對值反應菊花黃酮不同成分及量對抗氧化活性的大小，回歸系數絕對值越大，說明相關性越大；回歸系數的符號反應菊花黃酮不同成分與抗氧化活性相關性(正相關或負相關)。擬合出菊花黃酮不同成分及量與抗氧化活性之間的回歸線方程為Y= 0.191XQuercetin+ 0.196 XRutin+ 0.215 XBaicalin- 0.070 XApigenin+ 0.272 XChlorogenic acid。由此方程可知，各成分對抗氧化活性的貢獻大小為綠原酸 > 黃芩苷 > 蘆丁 > 槲皮素 > 芹菜素。其中，綠原酸、黃芩苷、蘆丁、槲皮素與黃酮樣品的抗氧化活性呈正相關，芹菜素與抗氧化活性呈負相關，且綠原酸對菊花黃酮化合物的抗氧化活性貢獻最大，這剛好與文獻中報道的結果一致[8]。

3 結論

實驗從菊花中提取黃酮化合物，HPLC分析其黃酮組成，DPPH法測其抗氧化活性，并以PLS探究樣品黃酮組分與抗氧化活性間的相關性。結果表明各菊花黃酮化合物均具有一定的抗氧化活性，且各菊花黃酮化合物種類及含量存在一定的差異。黃酮化合物組成與抗氧化活性間的相關性研究表明綠原酸、黃芩苷、蘆丁、槲皮素與黃酮樣品對抗氧化活性呈正相關，芹菜素與抗氧化活性呈負相關。