小檗堿通過TGF-β/Smad通路抑制TGF-β1誘導(dǎo)的人肝癌HepG2細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的研究

陳春苗，張國(guó)哲，劉平平，火躍芳，李廷利

(1. 江蘇醫(yī)藥職業(yè)學(xué)院藥學(xué)院，江蘇 鹽城 224005；2. 黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150040)

肝癌是肝臟的一種惡性腫瘤，是世界上最常見的癌癥類型之一，也是目前癌癥死亡的第三大原因，占癌癥導(dǎo)致死亡率的8.2%[1]。90%以上與癌癥相關(guān)的死亡是由癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的，肝癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移也是晚期患者死亡的首要原因[2]。越來(lái)越多的研究表明[3-4]，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、耐藥、侵襲、轉(zhuǎn)移有著密切的聯(lián)系，EMT主要是指在特定的腫瘤微環(huán)境下，極性較強(qiáng)的上皮細(xì)胞來(lái)源的腫瘤細(xì)胞向侵襲性和轉(zhuǎn)移性更強(qiáng)的間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的生物學(xué)過程，此過程可以促進(jìn)腫瘤組織中的腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處組織浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)是目前研究最廣泛和最有效的EMT誘導(dǎo)因子之一，其可以消除細(xì)胞間黏附作用及改變細(xì)胞形態(tài)，促進(jìn)間質(zhì)表型轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)癌細(xì)胞發(fā)生EMT[5]。

小檗堿(berberine)屬于異喹啉類生物堿，主要存在于小檗科、毛莨科、蕓香科、罌粟科和防己科等藥用植物中，其毒副作用小, 應(yīng)用前景極其廣闊，臨床上廣泛用于治療胃腸炎、細(xì)菌性痢疾等疾病，近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)小檗堿還具有明顯的降糖、調(diào)血脂、保護(hù)心血管、抗腫瘤等藥理作用[6]。小檗堿以往的抗腫瘤研究報(bào)道主要集中于其抑制腫瘤細(xì)胞增殖，以及誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡等方面，但是對(duì)于小檗堿能否抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肝癌HepG2細(xì)胞遷移、侵襲和EMT的作用及其機(jī)制仍未見報(bào)道。本研究旨在探討小檗堿對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞EMT的影響，以及TGF-β/Smad信號(hào)通路在此過程中的作用。

1 材料

1.1 細(xì)胞系人肝癌HepG2細(xì)胞，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

1.2 藥物與試劑鹽酸小檗堿(中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110713-201814)； DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清FBS(美國(guó)Gibco公司)；DMSO、MTT(美國(guó)Sigma公司)；TGF-β1(美國(guó)PeproTech公司)；Transwell小室(美國(guó)BD公司)；DPAI細(xì)胞核染色液、RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(碧云天生物技術(shù)有限公司)；兔源一抗E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、Snail、 MMP-2、Smad2、p-Smad2、Smad3、p-Smad3、GAPDH(美國(guó)CST公司)；羊抗兔IgG二抗(武漢愛博泰克生物科技有限公司)；PVDF膜、ECL化學(xué)發(fā)光液(美國(guó)Millipore公司)。

1.3 儀器FORMA 371型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo Fisher 公司)； AE2000 型顯微鏡(中國(guó)Motic公司)；iMark型酶標(biāo)儀、Powerpac300型電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；Tanon-5200 型全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)；激光共聚焦掃描顯微鏡LCM 880(德國(guó)ZISS公司)。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與給藥人肝癌HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清、100 U·L-1青霉素、100 mg·L-1鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基中，置 37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。小檗堿用DMSO溶解配置成母液，給藥時(shí)用DMEM 高糖完全培養(yǎng)基稀釋成不同濃度。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[7]，采用10 ng·L-1TGF-β1孵育HepG2細(xì)胞誘導(dǎo)EMT形成。

2.2 MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HepG2細(xì)胞活力將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞以每孔約3×103個(gè)細(xì)胞100 μL接種于96孔板中，培養(yǎng)過夜，在96孔板中加入不同濃度小檗堿，每組6個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24 h、48 h后，每孔加入5 g·L-1MTT溶液10 μL，培養(yǎng)4 h后，吸棄上清，每孔加入150 μL DMSO溶液，搖床低速振搖10 min，在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定各孔吸光度，計(jì)算并繪出各組細(xì)胞活力柱狀圖。

2.3 克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HepG2細(xì)胞克隆形成能力將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2 細(xì)胞以每孔細(xì)胞數(shù)約為1×103個(gè)接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入10 ng·L-1TGF-β1和不同濃度的小檗堿，培養(yǎng)大約2周后，每孔加入4%的多聚甲醛固定，然后加入0.1%的結(jié)晶紫染色，沖洗干凈，拍照，計(jì)算各組細(xì)胞克隆數(shù)量。

2.4 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HepG2細(xì)胞遷移能力將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞以每孔細(xì)胞數(shù)約為5×105個(gè)接種于6孔板中，待細(xì)胞融合度達(dá)85%左右后，用10 μL的移液槍在每孔劃出3道豎線，PBS洗去被劃下的細(xì)胞，之后在6孔板中加入10 ng·L-1TGF-β1和不同濃度的小檗堿，記為0 h，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h；并用倒置顯微鏡觀察和拍攝各組細(xì)胞0 h和24 h細(xì)胞劃痕的狀態(tài)。

2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HepG2細(xì)胞侵襲能力將帶Matrigel膠的Transwell小室放于24孔板中，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞用含1%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液，Transwell小室上室加入3×104個(gè)細(xì)胞200 μL含不同濃度的小檗堿培養(yǎng)基，Transwell下室中加入含15%胎牛血清和10 ng·L-1TGF-β1的DMEM高糖培養(yǎng)基800 μL，培養(yǎng)48 h；4%多聚甲醛固定后，用棉簽輕輕擦去Transwell上室中的Matrigel膠和細(xì)胞，倒置顯微鏡下觀察Transwell下室中各組細(xì)胞侵襲情況，隨機(jī)選擇 5個(gè)視野計(jì)算穿膜細(xì)胞數(shù)。

2.6 免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HepG2細(xì)胞EMT標(biāo)記物將細(xì)胞爬片置于12孔板中，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞以每孔細(xì)胞數(shù)約為2×104個(gè)接種于爬片上，待細(xì)胞貼壁后，加入10 ng·L-1TGF-β1和不同濃度的小檗堿培養(yǎng)48 h后，4%多聚甲醛固定，加入含0.3% TritonX-100的10% BSA封閉1 h，加入一抗，4 ℃孵育過夜，加入熒光二抗室溫避光孵育1 h，加入DAPI 染色10 min，熒光淬滅封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡觀察并采集圖像。

2.7 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HepG2細(xì)胞以每孔約為3×105個(gè)接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁后，加入10 ng·L-1TGF-β1和不同濃度的小檗堿培養(yǎng)48 h后，用預(yù)冷的PBS洗2遍，加入含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解液，冰上裂解30 min，吸至1.5 mL的EP管中，4 ℃離心10 min，采用BCA試劑盒定量蛋白濃度。使用10%的SDS-PAGE分離蛋白樣品，濕轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)到PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，一抗4 ℃孵育過夜，二抗室溫孵育1 h，化學(xué)發(fā)光法顯影，運(yùn)用全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析，檢測(cè)蛋白表達(dá)情況。

3 結(jié)果

3.1 小檗堿對(duì)HepG2細(xì)胞活力的影響如MTT結(jié)果所示(Fig 1)，與正常對(duì)照組相比，低濃度(1～4 μmol·L-1)小檗堿處理HepG2 細(xì)胞24 h、48 h后，HepG2細(xì)胞活性沒有變化，小檗堿濃度增加至8～64 μmol·L-1時(shí)，可以呈濃度-時(shí)間依賴性抑制HepG2細(xì)胞活性(P<0.05，P<0.01)。為排除小檗堿對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的遷移侵襲和EMT的影響是由抑制HepG2 細(xì)胞活性所造成的，因此，選擇殺傷作用較弱的小檗堿濃度(1、2、4 μmol·L-1)開展后續(xù)EMT實(shí)驗(yàn)研究。

3.2 小檗堿對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞克隆形成能力的影響克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(Fig 2)，TGF-β1處理的HepG2 細(xì)胞的克隆數(shù)量明顯比正常組多(P<0.01)；與TGF-β1模型組對(duì)比，給予小檗堿(1、2、4 μmol·L-1)干預(yù)后，HepG2細(xì)胞的克隆數(shù)量明顯減少(P<0.01)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了小檗堿可以顯著減弱TGF-β1增加的HepG2細(xì)胞克隆形成能力。

Fig 1 Effect of berberine on viability of HepG2

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

3.3 小檗堿對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響癌細(xì)胞發(fā)生EMT進(jìn)程中，其會(huì)獲得更強(qiáng)的遷移和侵襲能力，劃痕和Transwell小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示(Fig 3)，與正常組相比，TGF-β1可以明顯增加HepG2細(xì)胞的遷移和侵襲能力(P<0.01)；與TGF-β1模型組對(duì)比，給予小檗堿(1、2、4 μmol·L-1)干預(yù)后，HepG2細(xì)胞的遷移和侵襲能力減弱(P<0.05)。這些結(jié)果表明小檗堿能有效抑制TGF-β1增強(qiáng)的HepG2細(xì)胞遷移和侵襲能力。

3.4 小檗堿對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞EMT標(biāo)志物蛋白的影響Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示(Fig 4)，與正常組對(duì)比，TGF-β1明顯減弱了HepG2細(xì)胞中上皮標(biāo)記物 E-cadherin蛋白的表達(dá)水平，增加了間質(zhì)標(biāo)記物和轉(zhuǎn)錄因子N-cadherin、Snail、 MMP-2蛋白的表達(dá)水平(P<0.01)；與TGF-β1模型組對(duì)比，給予小檗堿(1、2、4 μmol·L-1)干預(yù)后，N-cadherin、Snail、 MMP-2蛋白表達(dá)水平降低，E-cadherin蛋白的表達(dá)水平增加(P<0.01)。如Fig 5激光共聚焦顯微鏡觀察的結(jié)果所示，與正常組相比，TGF-β1明顯增加了EMT間質(zhì)標(biāo)記物Vimentin綠色熒光的表達(dá)；而4 μmol·L-1小檗堿則明顯降低了TGF-β1增加的Vimentin綠色熒光表達(dá)水平。這些結(jié)果證實(shí)了小檗堿可以有效地逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的肝癌HepG2細(xì)胞EMT的變化。

3.5 小檗堿對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的HepG2 細(xì)胞TGF-β/Smad通路的影響相關(guān)研究報(bào)道表明，TGF-β1可以激活Smad通路促進(jìn)癌細(xì)胞形成EMT[8]。如Fig 6中Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組比較，TGF-β1增加了HepG2細(xì)胞中p-Smad2、p-Smad3蛋白的表達(dá)水平(P<0.01)，Smad2、Smad3總蛋白水平不變；與TGF-β1模型組比較，給予小檗堿(1、2、4 μmol·L-1)干預(yù)后，p-Smad2、p-Smad3蛋白表達(dá)水平下降(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了小檗堿可以通過TGF-β/Smad信號(hào)通路逆轉(zhuǎn)TGF-β1誘導(dǎo)的EMT轉(zhuǎn)化。

4 討論

肝癌早期癥狀通常較為隱匿，多數(shù)患者早期幾乎沒有明顯癥狀，但一旦出現(xiàn)相關(guān)癥狀前往就診時(shí)，多數(shù)患者已經(jīng)是中晚期，此時(shí)肝癌細(xì)胞已經(jīng)發(fā)生轉(zhuǎn)移，出現(xiàn)多個(gè)病灶，轉(zhuǎn)移是癌癥患者臨床預(yù)后不良的重要原因之一，也是大多數(shù)患者死亡的重要原因[9]。癌細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移時(shí)，往往會(huì)伴隨著EMT的過程，即癌細(xì)胞的表型發(fā)生了明顯的變化，在此過程中，其上皮細(xì)胞的表型標(biāo)志物蛋白表達(dá)會(huì)逐漸喪失，如E-鈣黏蛋白(E-cadherin)，緊密連接蛋白-1(Zonula Occludens-1)等，同時(shí)癌細(xì)胞的間質(zhì)標(biāo)志物蛋白增加，如N-鈣黏蛋白(N-cadherin)、波形蛋白(Vimentin)、纖維連接蛋白(Fibronectin)等，肝癌細(xì)胞經(jīng)過EMT后細(xì)胞間黏附能力下調(diào), 遷移侵襲能力上調(diào), 從而使肝癌細(xì)胞向局部組織中浸潤(rùn), 通過血管或者淋巴管轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處的、骨組織等, 最終導(dǎo)致腫瘤患者死亡[10-11]。因此，研究肝癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用機(jī)制，找出一種毒性較低抑制肝癌細(xì)胞EMT的天然藥物，對(duì)臨床輔助治療肝癌及改善臨床預(yù)后具有重要的意義。相關(guān)研究表明[12-13]，小檗堿具有較強(qiáng)的抗腫瘤活性，可以誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞凋亡及抑制癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在進(jìn)一步研究小檗堿是否可以抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞EMT，及其相關(guān)作用機(jī)制。

Fig 2 Effect of berberine on TGF-β1-induced clonogenic potential of HepG2

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsTGF-β1 group

Fig 3 Effect of berberine on TGF-β1-induced migration (A) and invasion (B) of HepG2

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsTGF-β1 group

Fig 4 Effect of berberine on protein expression of E-cadherin, N-cadherin, Snail, MMP-2 induced by TGF-β1 in HepG2

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsTGF-β1 group

Fig 5 Effect of berberine on Vimentin expression induced by TGF-β1 in HepG2 cells determined by confocal microscopy

Fig 6 Effect of berberine on TGF-β/ Smad pathway in HepG2

**P<0.01vscontrol group;#P<0.05,##P<0.01vsTGF-β1 group

實(shí)驗(yàn)中為了排除較高濃度的小檗堿對(duì)HepG2細(xì)胞的殺傷作用，干擾到小檗堿抑制TGF-β1誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞遷移、侵襲和EMT，可能是由于小檗堿對(duì)HepG2細(xì)胞本身的殺傷作用，而不是小檗堿作用于TGF-β1所導(dǎo)致的；因此本實(shí)驗(yàn)首先通過MTT實(shí)驗(yàn)，篩選對(duì)HepG2細(xì)胞殺傷作用較弱的小檗堿(1、2、4 μmol·L-1)濃度，進(jìn)行后續(xù)EMT相關(guān)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低濃度的小檗堿(1、2、4 μmol·L-1)可以明顯抑制TGF-β1增強(qiáng)的HepG2細(xì)胞的克隆形成能力、遷移和侵襲能力；

TGF-β1作為一種有效的EMT誘導(dǎo)劑，在多種高表達(dá)TGF-β的腫瘤中，其可以通過自分泌和旁分泌的方式作用于細(xì)胞膜上的Ⅱ型受體(TβRⅡ)，并且磷酸化膜上的Ⅰ型受體(TβRⅠ)，激活胞質(zhì)內(nèi)的Smad通路，磷酸化的Smad 2與Smad 3再與Smad4 結(jié)合形成復(fù)合體進(jìn)入細(xì)胞核中，激活轉(zhuǎn)錄因子Snail、 ZEB、Twist后，便可抑制上皮標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)，上調(diào)間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin等蛋白表達(dá)，促進(jìn)EMT的形成[5,14]。研究表明，10 ng·L-1TGF-β1可以通過Smad信號(hào)通路上調(diào)Snail轉(zhuǎn)錄因子，促進(jìn)肝癌細(xì)胞的EMT[7]；多數(shù)腫瘤細(xì)胞發(fā)生侵襲或者EMT時(shí)會(huì)伴隨分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)，如 MMP-2，其可以溶解細(xì)胞外基質(zhì)、基底膜、血管內(nèi)壁等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶向其他組織部位浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移[15]。本研究通過Western blot和激光共聚焦實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)，小檗堿可以降低TGF-β1誘導(dǎo)的Smad信號(hào)通路，抑制p-Smad2和p-Smad的表達(dá)，以及降低了TGF-β1上調(diào)的間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin、Vimentin、Snail、 MMP-2蛋白表達(dá)，并且增加了TGF-β1下調(diào)的上皮標(biāo)志物E-cadherin蛋白表達(dá)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小檗堿逆轉(zhuǎn)了TGF-β1誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞EMT，使其發(fā)生了MET(mesenchymal-epithelial transition，即間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化)。

綜上所述，小檗堿可抑制TGF-β1誘導(dǎo)的肝癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力，其機(jī)制可能是通過調(diào)控TGF-β/Smad信號(hào)通路，抑制EMT的形成而實(shí)現(xiàn)的，這些初步研究為小檗堿在肝癌分子靶向治療的開發(fā)利用提供新的理論依據(jù)。