依托咪酯影響感覺刺激誘發(fā)小腦皮層分子層場電位變化的機制

申 威，邱德來，初春平，潘 文，金文哲

(延邊大學 1. 附屬醫(yī)院疼痛科、2.醫(yī)學部細胞功能研究中心,生理學與病理生理學教研室，吉林 延吉 133000)

依托咪酯(etomidate，ET)是一種作用強、短效的非巴比妥類靜脈麻醉藥，在臨床中被廣泛使用。前期在體電生理學和神經(jīng)藥理學手段研究發(fā)現(xiàn)，ET降低在體小腦皮層浦肯野細胞的單純峰電位放電頻率并具有濃度依賴性，ET(300 μM)完全抑制自發(fā)性單純性放電，但自發(fā)性復雜峰電位放電依然存在。ET(300 μM)不僅完全抑制自發(fā)性單純性放電，而且抑制自發(fā)性復雜峰電位放電小穗數(shù)量[1]。另有研究報道，ET通過激活 GABAA和甘氨酸受體來抑制在體小鼠小腦浦肯野細胞(Purkinje cell，PC)活性[2]，而目前為止ET影響在體動物小腦皮質分子層感覺信息處理的機制尚不清楚。因此，我們有必要深入研究ET對烏拉坦麻醉小鼠小腦分子層中感覺刺激誘發(fā)反應的影響，為探討ET對小腦皮層功能的影響機制做好前期準備。

1 材料

1.1 實驗動物健康♂或♀ HA/ICR小鼠，購自延邊大學實驗動物中心，許可證編號：SYXK (Ji) 2011-006。在光照周期(12 h ∶12 h)中，自由獲取食物和水。

1.2 儀器美國產(chǎn)Axopatch-200B膜片鉗放大器、1440AD/DA轉換器、膜片鉗專用顯微鏡(Nikon Eclipse E-600FN, Japan)、體視顯微鏡(Nikon,日本)、Clampex10.3數(shù)據(jù)采集與分析軟件及美國Sutter公司生產(chǎn)的MP-385電動微操縱器等。

1.3 藥物與試劑ET(批號：20140812)、SR95531、士的寧，購自Sigma-Aldrich(中國上海)。將所有化學品溶解形成溶液并保持冷凍成等分試樣,最后在含氧的人工腦脊液中以0.4ml/min的速度將它們灌流于小腦表面。

2 方法

2.1 動物模型的制備參照參考文獻[3]的模型制備方法，經(jīng)腹腔注射烏拉坦1.3 g·kg-1施行麻醉，并植入自制氣管導管妥善固定，然后將小鼠置于特制的腦立體定位儀上，用雙側耳棒固定頭部，在小腦CrusⅡ小葉進行開顱手術，開孔直徑約為1～1.5mm，將小鼠和腦立體定位儀同時固定在顯微鏡下，確定需要記錄的部位后進行電生理記錄。

2.2 分子層場電位記錄參照參考文獻[4]的場電位記錄方法，使用Multi-clamp700B放大器，通過D/A轉換器1440和Clampfit10.3軟件獲取感覺刺激活動數(shù)據(jù)。

3 結果

3.1 ET對感覺刺激誘發(fā)小腦皮層分子層場電位的影響吹風刺激(30 ms，60 psi)同側觸須墊誘發(fā)分子層產(chǎn)生正相波(P1) 和負相波(N1)。小腦表面灌流ET(50 μmol·L-1，10 min)明顯抑制 P1反應，導致振幅減少(P<0.05)。ET對P1振幅的抑制作用具有明顯的濃度依賴性，最低有效濃度為10 μmol·L-1，半數(shù)抑制濃度為64.57μmol·L-1，ET濃度為500μmol·L-1時，下降至基線的98.68%。

3.2 ET對感覺刺激誘發(fā)的P1動態(tài)特性的影響小腦表面灌流ET50 μmol·L-1，P1的半寬增加(P<0.05), P1曲線下面積明顯較小(P<0.05)，另外，ET明顯增加了P1的上升時間和衰減時間(P<0.05)。

3.3 ET對GABAA受體或甘氨酸受體被阻斷時感覺刺激誘發(fā)反應的影響小腦表面灌注GABAA受體拮抗劑SR95531(gabazine，20 μmol·L-1)阻斷感覺刺激誘發(fā)的GABA能反應P1，并顯示刺激誘發(fā)的興奮性反應N2。在SR95531的存在下，依托咪酯對N2的振幅沒有明顯影響(P>0.05)，N2的波形下面積與單獨給予gabazine時的波形下面積差異無顯著性(P>0.05)。這些結果表明ET通過 GABAA受體調節(jié)感覺刺激誘發(fā)小腦皮層分子層場電位反應。此外，在甘氨酸受體拮抗劑士的寧(strychnine，10 μmol·L-1)存在的情況下，感覺刺激對P1振幅沒有明顯影響(P>0.05)，再灌流ET(50 μmol·L-1，10 min)，P1振幅明顯下降(P<0.05)，這與單獨給予ET相似。這些結果表明，甘氨酸受體阻斷劑無法阻斷依托咪酯誘導的面部刺激誘發(fā)的抑制反應。

3.4 ET通過小腦皮層MLI抑制感覺刺激誘發(fā)的反應ET(50μmol·L-1，)給藥10 min明顯抑制自發(fā)性峰電位和觸覺誘發(fā)峰電位，自發(fā)性、感覺誘發(fā)鋒電位的標準化數(shù)量[(1.64±1.6)%、(21.0±6.4)%]較基線[(100.0±1.35)%、(102.0±10.07)%]降低(P<0.05)。這些數(shù)據(jù)表明小腦表面灌注依托咪酯會抑制小腦MLI中的自發(fā)性和感覺誘發(fā)的峰電位活動，導致分子層對感覺誘發(fā)抑制效應的減弱。

4 討論

依托咪酯可直接或間接作用于GABAA受體，產(chǎn)生GABA樣的作用，或增強GABA與GABAA受體結合所引起的效應，減少神經(jīng)元動作電位的發(fā)生頻率[5]。依托咪酯顯著抑制初級感覺皮層錐體細胞電壓門控性Na+離子通道，減小Na+電流，提示依托咪酯可能通過抑制初級感覺皮層神經(jīng)元Na+離子通道，降低神經(jīng)元興奮性，影響感覺信息的整合[6]。另有研究報道，依托咪酯可抑制大鼠海馬CA1區(qū)興奮性突觸傳遞，機制可能與增強突觸前GABA能性抑制性回路的興奮性有關[7]。

那么，ET如何影響小腦皮層功能的呢？ET對小腦皮層PC影響的受體機制已有報道[2]，如引言中所述，ET通過激活 GABAA和甘氨酸受體來抑制在體小鼠小腦PC活性。而我們研究結果顯示，依托咪酯明顯抑制小腦分子層中感覺刺激引起的 GABA 能反應的振幅，表明它可調節(jié) GABA 能的突觸傳遞。依托咪酯誘導的感覺誘發(fā) GABA 能振幅的減少可能是由于依托咪酯通過激活GABAA受體來抑制 MLIs介導的感覺誘發(fā)反應，通過MLI 響應刺激可導致 GABA 釋放減少。另一方面，依托咪酯誘導的GABA 能上升和衰減時間的延長，表明依托咪酯抑制 MLI-PC突觸內的GABAA受體活性。實際上，通過阻斷 GABAA 受體活性，依托咪酯未能增強小鼠小腦皮層平行纖維到浦肯野細胞的興奮性輸入，證實依托咪酯通過調節(jié) GABAA受體調節(jié)小腦皮層分子層感覺信息處理。我們未來將進一步研究ET對小腦皮層顆粒細胞層的影響，為進一步探討ET麻醉作用的細胞與分子機制奠定堅實的理論基礎。