白藜蘆醇通過誘導自噬減少肥胖小鼠骨骼肌組織GDF8表達的研究

費云飛,陳 莉,徐冬梅,曹瓊瓊,徐結茍,魯云霞

(1. 安徽醫科大學生物化學教研室，安徽 合肥 230032； 2.中國科技大學附屬第一醫院檢驗科，安徽 合肥 230001；3.安徽醫科大學免疫學教研室，安徽 合肥 230032)

骨骼肌是糖脂代謝的重要組織，肥胖可造成脂肪組織在肌組織中的積累以及肌肉萎縮，有氧代謝的Ⅰ型纖維減少和酵解代謝的Ⅱ型纖維增加[1]。 白藜蘆醇(resveratrol, RES)具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和延緩衰老等功效，代謝組學研究揭示RES在腹部肌肉組織中通過調節多條代謝途徑和代謝物的水平來降低飲食誘導的代謝風險[2]。

自噬-溶酶體系統負責肌肉，特別是肌肉萎縮時蛋白質的降解，越來越多的證據表明，自噬為維持肌肉質量和肌肉干細胞的再生功能所必需[3]。已知由白藜蘆醇介導的自噬流恢復可防止骨骼肌細胞衰老和改善胰島素抵抗[4]，但白藜蘆醇是否影響肥胖小鼠骨骼肌組織中的自噬尚未見文獻報道。

GDF8(growth differentiation factor 8)基因是轉化生長因子TGFβ 家族的一員，其表達產物myostatin是體內重要的肌肉生長抑制因子[5]。肥胖可通過增加GDF8的表達來退行性地減少肌肉的質量和功能[6]。已有研究表明GDF8的失活可導致AMPK水平和活性升高，造成骨骼肌的胰島素敏感性增加[7]。我們推測白藜蘆醇可能通過激活骨骼肌組織中的自噬水平來減少GDF8的表達。白藜蘆醇是天然無毒化合物，但作用較緩慢，因此參照文獻選取單一劑量白藜蘆醇(400 mg·kg-1·d-1)灌胃治療20周[8]。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗動物 C57 BL/6雄性(♂)清潔級小鼠24只，7 weeks，由安徽醫科大學實驗動物中心提供(合格證編號SCXK(皖)2011-001)，12 h日/夜交替，自由進食，相對濕度40%～60%，適應性喂養1周后隨機分組進行實驗。

1.1.2藥物與試劑 高脂飼料購自北京峁思倍科生物技術有限公司，HD001，蛋白質19.6%，碳水化合物46.4%，脂肪34.0%。白藜蘆醇(阿拉丁公司，R107315)；RNAStore樣品保存液、TRIzol試劑和逆轉錄試劑盒RevertTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Clontech TaKaRa)；LC3、p62、GDF8引物購自通用生物系統(安徽)有限公司，GAPDH、SIRT1引物購自上海生工生物有限公司。Rabbit Anti-myostatin一抗購于Bioss公司(貨號：bs-1288R)；SIRT1 Mouse mAb、LC3 Rabbit mAb購買于CST公司(貨號：#8459、#4445)，Anti-p62一抗購買于Millipore公司(貨號：#MABC32)；羊抗兔或羊抗鼠酶標二抗購自Affinity公司。

1.1.3儀器 羅氏7600 d全自動生化分析儀；TG1650-WS高速離心機(上海盧湘儀有限公司)； 德國萊卡 RM2235型石蠟切片機；TECHNE TC-512 PCR儀(英國公司)；041BR型電泳儀和電轉移、電泳槽(BIO-RAD)；Western blot曝光儀(上海勤翔3600型)，凝膠成像儀(上海勤翔GenoSens1580型)。

1.2 方法

1.2.1分組及模型制備 將C57 BL/6小鼠隨機分為標準飲食組(SCD)、標準飲食+胃飼白藜蘆醇組(SCD+RES)、高脂組(HFD)和高脂+胃飼白藜蘆醇組(HFD+RES)。后兩組均為HFD喂養，HFD+RES組和SCD+RES組在HFD和SCD的同時用白藜蘆醇(400 mg·kg-1·d-1)灌胃，治療20周。操作均遵守安徽醫科大學實驗動物倫理委員會要求。

1.2.2血清學指標檢測 所有小鼠于前日禁食12小時，稱取體質量，2%戊巴比妥腹腔麻醉，腹主動脈負壓采血，顛倒混勻含有分離膠的真空采血管后靜置，5 000 r·min-1離心10 min，留取血清樣本，分析每只小鼠血清的TG、TC、HDL-C、LDL-C水平。完全剝離小鼠的肌肉組織，1/3的肌肉組織于4%多聚甲醛固定液中固定，1/3的肌肉組織于DEPC水清洗后置于RNA保護液中暫存，轉存于-80 ℃冰箱中備用，剩余1/3的肌肉組織于液氮中暫存過夜，轉入-80 ℃冰箱保存備用。

1.2.3HE染色 制備4%的中性多聚甲醛，取每只小鼠的部分骨骼肌組織，PBS清洗，于固定液中固定，1周內更換固定液2～3次，制備組織切片，常規Hematoxylin-eosin染色，光鏡下觀察，拍照并分析。

1.2.4免疫組化分析 多聚甲醛固定骨骼肌組織，行組織脫水處理，制備包埋塊，連續厚4 μm切片，脫蠟、脫水處理，免疫組化制片，隨后進行Myostain、SIRT1、LC3、p62的一抗4～8 ℃過夜孵育，二抗室溫孵育，待完成制片，染色后光鏡下觀察，拍照并軟件分析各組積分光密度值(IOD)。

1.2.5RT-PCR 電子天平稱取0.1 g骨骼肌組織，提取Total RNA，測量總RNA濃度，根據所測濃度調節RNA上樣量，逆轉錄合成cDNA，在PCR儀上進行擴增，產物經電泳分離后，拍照并分析灰度值，以目的基因灰度值/GAPDH灰度值來表示mRNA水平。目的基因及引物序列見Tab 1。

Tab 1 Primer sequences for target genes

1.2.6Western blot 每組選取3只小鼠稱取100 mg骨骼肌組織，裂解提取各組骨骼肌組織的Protein，測量各組protein濃度，根據測量濃度調節上樣量，12% SDS-PAGE電泳分離，轉膜，于β-actin(1 ∶2 500)、LC3(1 ∶1 000)、p62(1 ∶2 000)、myostatin(1 ∶500)、SIRT1(1 ∶1 000)一抗中，4～8 ℃搖床孵育過夜，漂洗，二抗(1 ∶10 000)室溫2 h，漂洗，顯色成像，Western blot軟件分析灰度值，以目的蛋白 /β-actin來表示目的蛋白水平，實驗重復3次。

2 結果

2.1 白藜蘆醇對肥胖小鼠血脂指標的影響結果如Tab 2所示，與SCD組比較，標準飲食的小鼠給予白藜蘆醇胃飼，兩組間小鼠體質量和血脂各項指標略有變化。然后與SCD組小鼠相比，高脂飲食導致小鼠過度肥胖，其血脂指標中HDL-C降低(P<0.05或P<0.01)，同時TC、TG、LDL-C均明顯高于SCD組，對于高脂飲食所致的肥胖小鼠給予白藜蘆醇治療，其血脂指標中TC、TG、LDL-C均低于HFD組(P<0.05)，而HDL-C與HFD組比較明顯升高(P<0.05)。

2.2 白藜蘆醇對肥胖小鼠骨骼肌病理學的影響HE結果顯示，標準飲食(SCD)小鼠與標準飲食胃飼白藜蘆醇(SCD+RES)小鼠的形態學差異無顯著性(P>0.05)。與SCD組相比，高脂飲食所致肥胖小鼠的骨骼肌組織中肌纖維間有明顯的脂質沉積。而給予白藜蘆醇治療的小鼠骨骼肌組織的脂質沉積消失(Fig 1)。

2.3 白藜蘆醇對肥胖小鼠免疫組化的影響標準飲食和標準飲食胃飼白藜蘆醇兩組小鼠的GDF8、LC3、p62、SIRT1均表達于胞質中，且差異無統計學意義(P>0.05)。與SCD組相比，HFD所致的肥胖小鼠骨骼肌中GDF8和p62的表達呈增高趨勢(P<0.05，P<0.001)，LC3和SIRT1表達水平相對較低(P<0.05，P<0.01)；而白藜蘆醇治療的肥胖小鼠骨骼肌中GDF8和p62表達明顯下降(P<0.05，P<0.01)，而LC3和SIRT1的表達水平呈增高趨勢(P<0.05)(Fig 2)。

Tab 2 Effects of RES on body mass and serum lipids in hyperlipidemic

*P<0.05,**P<0.01vsSCD;#P<0.05,##P<0.01vsHFD

Fig 1 Morphology of skeletal muscle tissues of mice(HE staining,×400)

Fig 2 Immunohistochemical results of GDF8, LC3, p62, SIRT1 in skeletal muscle tissues of

*P<0.05,**P<0.01vsSCD;#P<0.05,##P<0.01vsHFD. White arrows show positive areas in the skeletal muscle tissues.

2.4 白藜蘆醇對高脂血癥小鼠mRNA表達的影響與SCD組相比，HFD導致小鼠肥胖，進而使骨骼肌中SIRT1、LC3的mRNA 表達降低(P<0.05)，而p62、GDF8的mRNA表達明顯升高(P<0.05)；與HFD組相比，白藜蘆醇治療組骨骼肌中SIRT1、LC3的目的基因表達明顯升高(P<0.05)，p62、GDF8 目的基因表達量降低(P<0.05)(Fig 3)。

2.5 白藜蘆醇對高脂血癥小鼠蛋白質表達的作用與標準飲食的小鼠相比，高脂飲食所致的小鼠骨骼肌中SIRT1、LC3 protein相對含量較低(P<0.05)，同時，p62、GDF8 水平相對較高，且差異有統計學意義(P<0.05)；與HFD組相比，白藜蘆醇治療的肥胖小鼠(HFD+RES)骨骼肌中SIRT1、LC3 蛋白質表達升高(P<0.05)，p62、GDF8 蛋白質表達明顯降低(P<0.05)(Fig 4)。

3 討論

骨骼肌是參與脂代謝的重要組織，脂類的分解代謝提供了靜息肌肉能量利用的很大比例，但長期的高脂飲食反而會造成骨骼肌的代謝障礙。本實驗結果顯示，高脂飲食可導致脂肪組織在骨骼肌組織中的積累p62和GDF8的表達升高、伴隨著SIRT1、LC3的表達降低，白藜蘆醇則通過激活骨骼肌組織中SIRT1的表達來促進以LC3II表達升高、p62表達降低為代表的自噬體的形成，以降解高脂飲食時誘導生成的過多的myostatin。

Fig 3 RT-PCR results of GDF8, LC3, p62, SIRT1 in skeletal muscle tissues of

**P<0.01vsSCD;##P<0.01vsHFD

Fig 4 Western blot results of GDF8, LC3, p62, SIRT1 in skeletal muscle tissues of

**P<0.01vsSCD,##P<0.01vsHFD

過度的脂肪攝入通過細胞損傷和炎癥引起代謝性疾病的進展，此即為“脂毒性”。已有研究表明，高脂飲食可引起腎近曲小管細胞內溶酶體功能的異常，造成自噬流的受損[9]。骨骼肌作為高代謝器官，對高脂飲食中的飽和脂肪酸特別敏感，棕櫚酸可誘導自噬活性降低，表現為減少自噬體形成的標志物LC3II的表達[10]，白藜蘆醇作為SIRT1 的強激活劑可誘導自噬[11]，與本研究的結果一致。另有文獻報道白藜蘆醇可通過不同的機制激活AMPK和SIRT1，上調Atg5和Atg12的基因表達，增加LC3脂化來調節自噬[12-13]。

myostatin是1997年由美國John Hopkins 大學醫學部研究人員在小鼠骨骼肌中發現的新型生長因子。GDF8 基因缺失可誘導肌肉量增加，降低脂肪含量，抑制飲食引起的肥胖[14]。另一方面，23周的高脂高蔗糖飲食可誘導微型豬的體質量增加，脂類在骨骼肌中的異位沉積和肌萎縮，伴隨著GDF8的表達增加[6]。本研究的高脂飲食一共持續20周，也觀察到類似的現象，提示GDF8可能是治療高脂飲食誘導的骨骼肌代謝障礙的新靶點。

SIRT1在成肌細胞的增殖和分化中起關鍵的作用，myostatin則是成肌細胞的關鍵調節因子。研究表明myostatin缺失小鼠的骨骼肌中除AMPK的表達和活性增加外，也顯著增加了AMPK下游SIRT1和PGC1α的表達[7]。SIRT1的抑制劑尼克酰胺可通過SIRT1依賴的方式抑制C2C12細胞的增殖和促進myostatin的表達，myostatin信號通路的抑制劑SB431542則可逆轉尼克酰胺的增殖抑制效應，并促進SIRT1的表達[15]。本研究結果表明，SIRT1激活劑白藜蘆醇可能通過增加SIRT1的表達，改善高脂飲食導致的自噬流受損，進而促進myostatin的降解；經數據庫檢索，此研究尚未見文獻報道。

SIRT1是AMPK信號通路下游的一個靶基因， 本研究未能探究白藜蘆醇治療的肥胖小鼠骨骼肌中AMPK的表達和活性的變化，并進一步探索GDF8與AMPK信號通路的關系，這將是本實驗后期的主要研究內容。

綜上所述，白藜蘆醇對高脂飲食誘導肥胖的骨骼肌組織有保護作用，其機制可能與促進SIRT1的表達，誘導自噬活性升高，進而減少GDF8的表達有關。本實驗結果可為白藜蘆醇的臨床應用于肥胖狀態下的骨骼肌萎縮等疾病治療提供科學依據，同時也為白藜蘆醇預防高脂飲食下骨骼肌萎縮的具體作用機制研究奠定基礎。