天麻素對(duì)甲基苯丙胺誘導(dǎo)的神經(jīng)元毒性損害的保護(hù)作用

閆倩文，石振金，張楓弋，周一卿，黃兆奎，王一航，張冬先，洪仕君，李利華

(昆明醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院,云南 昆明 650500)

甲基苯丙胺(methamphetamine，MA)的濫用給人體健康和社會(huì)安定造成了極大地危害。目前，MA濫用人員呈低齡化趨勢(shì)，嚴(yán)重危害青少年身體健康。褪黑素(melatonin，MT)可通過(guò)調(diào)控下丘腦視上核交叉的沖動(dòng)發(fā)放頻率來(lái)改善睡眠，具有抗氧化應(yīng)激，保護(hù)線粒體，抗凋亡，還有調(diào)節(jié)免疫、抑制腫瘤生長(zhǎng)、延緩衰老、降血壓及鎮(zhèn)痛等多重功效[1]。大量研究結(jié)果提示，MT可以緩解MA誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性損害。MT可通過(guò)降低MA介導(dǎo)的氧化應(yīng)激起到保護(hù)作用，此外它還可以維持線粒體的穩(wěn)態(tài)、降低神經(jīng)炎癥因子等的表達(dá)[2]。體內(nèi)研究表明，MT可以對(duì)抗MA暴露導(dǎo)致的高熱、多巴胺降低以及多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體的減少[3]。

天麻素(gastrodin，GAS)是云南特有植物藥物天麻最主要的活性成分。臨床上多用于治療頭暈、神經(jīng)退行性疾病等。本課題組此前致力于研究天麻素在毒品戒斷方面的作用并取得初步研究結(jié)果[4-5]。本研究選取眾多研究確認(rèn)對(duì)MA誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性損害有保護(hù)作用的MT作為陽(yáng)性對(duì)照，探討天麻素對(duì)MA誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性損害的保護(hù)作用及其效果，為毒品戒斷治療藥物的篩選提供新的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑鹽酸甲基苯丙胺由云南公安刑事科學(xué)技術(shù)研究所合法提供，配制成10 g·L-1(53.85 mmol·L-1)溶液(生理鹽水稀釋)，過(guò)濾除菌，4 ℃保存。天麻素由生物醫(yī)學(xué)研究工程中心陸地教授贈(zèng)予，配制成10 g·L-1(33.86 mmol·L-1)溶液(生理鹽水稀釋)，過(guò)濾除菌，4 ℃保存。MT(Meilunbio 公司，MB1475-S)，用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解為20 g·L-1，-20 ℃避光保存。聚-L-賴氨酸 氫溴酸鹽(Sigma公司，P2636)；DMEM培養(yǎng)基(Biological Industries公司，01-050)、胰酶(Biological Industries公司，03-050)；神經(jīng)元培養(yǎng)基、B27 supplement、胎牛血清、雙抗、谷氨酰胺(Gibco公司)；DMSO(Solarbio公司，D8370)，DNA酶(Solarbio公司，D8071)，細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒(Cell Counting Kit-8, CCK-8)(Biosharp公司，BS350B)；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Roche公司，11684795910)；含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinasecysteinyl aspartate specific proteinase-3, caspase-3)抗體(兔抗，1 ∶200，Proteintech公司，19677-1-AP)； 神經(jīng)元標(biāo)志物(the class III β tubulin specific antibody, Tuj1)(鼠抗，1 ∶200，Proteintech公司，66375-1-Ig)；熒光二抗(DyLight 488, Goat anti-mouse IgG 1 ∶500，Abbkine 公司，A23210)；熒光二抗(Dylight 594, Goat anti-rabbit IgG，1 ∶500，Abbkine 公司，A23420)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)24 h內(nèi)新生SD大鼠，購(gòu)于昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK(滇)K2015-0002。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器超凈臺(tái)(Thermo scientific公司)，二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo scientific公司),倒置顯微鏡(Leica公司)，全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(Thermo公司)，熒光顯微鏡(Leica公司)。

1.4 方法

1.4.1細(xì)胞培養(yǎng) 取SPF級(jí)24 h內(nèi)新生SD大鼠，75%冷乙醇浸泡3～5min無(wú)菌條件下斷頸處死，取腦，顯微鏡下剝離腦膜，夾取皮質(zhì)組織，剪碎，胰酶37 ℃消化10 min，終止消化后過(guò)濾，離心，加適量培養(yǎng)基重懸制成細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，按既定濃度接種于培養(yǎng)板，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h后換神經(jīng)元培養(yǎng)基，3 d后給藥。

1.4.2不同濃度MA對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元活性的影響 細(xì)胞以4×105～5×105的接種密度接種于96孔板，培養(yǎng)72 h后加不同濃度MA溶液(0 mmol·L-1、0.125 mmol·L-1、0.25 mmol·L-1、0.5mmol·L-1、1 mmol·L-1、2 mmol·L-1)分別處理24 h，每組3個(gè)復(fù)孔。棄掉培養(yǎng)基，每孔加90 μL神經(jīng)元培養(yǎng)基和10 μL CCK-8混合液，溫箱孵育2 h后測(cè)定細(xì)胞活力值。用全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀測(cè)量波長(zhǎng)450 nm的吸光度值，檢測(cè)不同濃度的MA對(duì)神經(jīng)元活性的影響。

1.4.3不同濃度GAS對(duì)MA誘導(dǎo)的皮質(zhì)神經(jīng)元毒性損害的保護(hù)作用 皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)3 d后，加不同濃度GAS(0 mg·L-1、12.5 mg·L-1、25 mg·L-1、50 mg·L-1、100 mg·L-1)分別處理2 h后，再給MA最佳給藥濃度作用24 h，每組3個(gè)復(fù)孔。用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力值，確定最佳干預(yù)濃度。

1.4.4不同濃度MT對(duì)MA誘導(dǎo)的皮質(zhì)神經(jīng)元毒性損害的保護(hù)作用 皮質(zhì)神經(jīng)元培養(yǎng)3 d后，加不同濃度MT(0、0.1、1、10、100 μmol·L-1),分別處理2 h后，再給MA最佳給藥濃度24 h。用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞活力值，確定最佳干預(yù)濃度。

1.4.5細(xì)胞免疫熒光技術(shù)、DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法(terminal dexynucleotidyl transferase(TdT)-mediated dUTP nick end labeling, TUNEL)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 培養(yǎng)細(xì)胞3 d后，隨機(jī)分為對(duì)照組、0.5 mmol·L-1MA組、25 mg·L-1GAS+0.5 mmol·L-1MA組、10 μmol·L-1MT+0.5 mmol·L-1MA組，每組3個(gè)復(fù)孔。棄掉培養(yǎng)基，用PBS洗滌3次×3 min；加1ml 4%多聚甲醛溶液固定15 min，然后滴加PBS 3次×3 min。取出爬片置于載玻片上，滴加含5%羊血清0.3%Triton的PBS(0.01mol·L-1)封閉液100 μL，37 ℃孵育30min；棄掉封閉液，滴加一抗(Tuj1抗體1：200，Caspase-3抗體1 ∶200)，4 ℃過(guò)夜。PBS漂洗3次×3 min；避光加入二抗(1 ∶500)和TUNEL反應(yīng)混合液，37 ℃避光孵育1 h；漂洗3次×3 min；滴加含DAPI的抗熒光淬滅劑進(jìn)行細(xì)胞核染色，室溫孵育3 min；將玻片倒扣在載玻片上，熒光顯微鏡觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞活力值測(cè)定MA給藥組細(xì)胞活力值如Fig 1A所示，與對(duì)照組相比，0.5 mmol·L-1MA組、1 mmol·L-1MA組、2 mmol·L-1MA組細(xì)胞活力顯著降低(P<0.01)；0.5mmol·L-1MA組與0.125 mmol·L-1MA、0.25 mmol·L-1MA組相比皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞活力顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；1 mmol·L-1MA組、2 mmol·L-1MA組細(xì)胞活力比0.5 mmol·L-1MA組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；據(jù)此確定MA最佳給藥濃度為0.5 mmol·L-1。

GAS+MA組細(xì)胞活力值如Fig 1B所示，與0.5 mmol·L-1MA組相比，25 mg·L-1GAS+0.5 mmol·L-1MA組細(xì)胞活力值顯著上升(P<0.01)；故選取25 mg·L-1作為GAS最佳干預(yù)濃度。

MT+MA組細(xì)胞活力值如Fig 1C所示，與0.5 mmol·L-1MA組相比，10 μmol·L-1MT+0.5 mmol·L-1MA組細(xì)胞活力值明顯上升(P<0.05)；故選取10 μmol·L-1作為MT最佳干預(yù)濃度。

2.2 不同實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞形態(tài)改變

2.2.1不同MA劑量給藥組細(xì)胞形態(tài)改變 如Fig 2所示，隨著MA濃度增加，皮質(zhì)神經(jīng)元胞體逐漸皺縮，出現(xiàn)空泡化，甚至死亡；突觸也逐漸變短消失。當(dāng)MA濃度為2 mmol·L-1時(shí)，細(xì)胞幾乎全部死亡，突觸消失。

2.2.2不同劑量GAS+MA給藥組細(xì)胞形態(tài)改變 如Fig 3所示，與對(duì)照組比較，MA組細(xì)胞數(shù)目減少，突觸變細(xì)小、斷裂；不同劑量天麻素干預(yù)后，有細(xì)胞形態(tài)呈不同程度改善。

Fig 1 Cell viability value of different experimental groups

2.2.3不同劑量MT+MA給藥組的細(xì)胞形態(tài)改變 如Fig 4所示，與對(duì)照組比較，MA組細(xì)胞皺縮，數(shù)目減少，突觸變短；不同劑量MT干預(yù)后細(xì)胞形態(tài)呈不同程度改善。

Fig 2 Morphological changes of cortical neurons after 24 h treatment with different concentrations of MA

A: Control group; B: 0.125mmol·L-1MA group; C: 0.25mmol·L-1MA group; D: 0.5 mmol·L-1MA group; E: 1mmol·L-1MA group; F: 2 mmol·L-1MA group. The arrow showed typical morphological changes of cortical neuron.

2.3 細(xì)胞凋亡率檢測(cè)細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果如Fig 5、6所示，與對(duì)照組相比，MA組TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞顯著增多(P<0.01)；GAS+MA組和MT+MA組的TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞比MA組顯著減少(P<0.01)；GAS+MA組和MT+MA組TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明對(duì)MA誘導(dǎo)皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的干預(yù)影響，天麻素可達(dá)到與MT一樣的干預(yù)效果。

2.4 各實(shí)驗(yàn)組Caspase-3的表達(dá)與對(duì)照組比較，MA組Caspase-3表達(dá)明顯增強(qiáng)；GAS+MA組和MT+MA組Caspase-3均比MA組明顯降低。Caspase-3染色陽(yáng)性細(xì)胞，經(jīng)過(guò)計(jì)數(shù)和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示天麻素對(duì)MA誘導(dǎo)的皮質(zhì)神經(jīng)元細(xì)胞凋亡具有緩解作用，效果與MT相當(dāng)(Fig 7)。

3 討論

已有的研究表明，MA可以導(dǎo)致多巴胺和5羥色胺能神經(jīng)元終末端的損傷，軸突末端可發(fā)生腫脹、歪曲、退化等形態(tài)學(xué)改變；MA還可以導(dǎo)致細(xì)胞死亡，在額葉皮質(zhì)、紋狀體、海馬等部位均檢測(cè)出細(xì)胞凋亡[6]。研究表明，氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙可能導(dǎo)致MA誘導(dǎo)的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞凋亡[7]。本研究選取檢測(cè)凋亡的TUNEL法染色和提示細(xì)胞凋亡的指標(biāo)Caspase-3，比較天麻素和MT的干預(yù)效果。

Fig 3 Morphological changes of cortical neurons with different concentrations of gastrodin pre-treatment of 2 h and post-treatment of MA (0.5 mmol·L-1) for 24 h

A: Control group; B: 0.5 mmol·L-1MA group; C: 12.5 mg·L-1GAS+0.5 mmol·L-1MA group; D:25 mg·L-1GAS+0.5mmol·L-1MA group; E: 50 mg·L-1GAS+0.5 mmol·L-1MA group; F: 100 mg·L-1GAS+0.5 mmol·L-1MA group.

研究結(jié)果提示，隨著MA濃度增加，皮質(zhì)神經(jīng)元胞體逐漸萎縮，有的可見(jiàn)空泡樣結(jié)構(gòu)，突觸逐漸變細(xì)、回縮、斷裂，消失。當(dāng)MA濃度為2 mmol·L-1時(shí)，視野中細(xì)胞胞體幾乎全部失去原有正常形態(tài)，胞體萎縮、死亡，突觸消失。說(shuō)明MA對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元已經(jīng)造成明顯毒性損害作用。通過(guò)不同梯度濃度干預(yù)細(xì)胞后，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元的活力值與MA作用濃度呈負(fù)相關(guān)，MA濃度為0.5 mmol·L-1時(shí)，可對(duì)皮質(zhì)神經(jīng)元造成近半數(shù)致死的毒性損害。

MA在小鼠模型中可誘導(dǎo)神經(jīng)元發(fā)生固縮、變性、壞死等病變，其程度與劑量和作用時(shí)間緊密相關(guān)[8]。MA的神經(jīng)毒性雖已被公認(rèn)，但其作用機(jī)制研究尚不明確，已有的研究結(jié)果主要涉及細(xì)胞凋亡、自噬、谷氨酸興奮性毒性、能量代謝、突觸可塑性、氧化應(yīng)激等方面。

Fig 4 Morphological changes of cortical neurons with different concentrations of melatonin pre-treatment of 2 h and post-treatment of MA (0.5 mmol·L-1) for 24 h

A: Control group; B: 0.5 mmol·L-1MA group; C: 0.1 μmol·L-1MA+0.5 mmol·L-1MA group; D: 1 μmol·L-1MA+0.5 mmol·L-1MA group; E: 10 μmol·L-1MA+0.5 mmol·L-1MA group; F: 100 μmol·L-1MA+0.5 mmol·L-1MA group.

MT的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制也涉及多個(gè)方面。線粒體氧化損傷和蛋白激酶Cδ(一種蛋白激酶C家族亞型)過(guò)度表達(dá)，促成甲基苯丙胺誘導(dǎo)的多巴胺能變性，MT對(duì)MA介導(dǎo)的線粒體負(fù)荷(功能障礙)、氧化應(yīng)激、促凋亡的保護(hù)作用和蛋白激酶Cδ有關(guān)[9]。還有研究發(fā)現(xiàn)，MA作用于血腦屏障引起炎癥反應(yīng)而產(chǎn)生神經(jīng)毒性，MT可以通過(guò)作用于MT受體，對(duì)MA介導(dǎo)的血腦屏障炎癥反應(yīng)起到保護(hù)作用[10]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究表明，在小鼠MA依賴的模型中，絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路的活性降低，N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受體亞基NR2A和NR2B以及鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶II(CaMKII)表達(dá)改變，經(jīng)過(guò)MT預(yù)處理后，可以減弱上述變化促進(jìn)細(xì)胞增殖，實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)ERK信號(hào)通路的活性下降[11]，課題組也正在開(kāi)展相關(guān)的研究工作。Kongsuphol等[12]研究發(fā)現(xiàn)，MA抑制了哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的磷酸化以及下游靶蛋白的表達(dá)，MT預(yù)處理可以增強(qiáng)mTOR活性及其下游蛋白4E結(jié)合蛋白-1(eukaryotic trans-lation initiation factor 4E-binding protein 1，4EBP1)的活性，這也是我們后續(xù)研究跟進(jìn)的方向。

Fig 5 Effects of gastrodin and melatonin pre-treatment for 2 h on cortical neuron apoptosis induced by MA treatment for 24 h

A: Control group; B: MA group; C:Gastrodin 25 mg·L-1+0.5 mmol·L-1MA group; D: Melatonin10 μmol·L-1+0.5 mmol·L-1MA group. DAPI (blue) staining showed the nucleus, Tuj1 (green) staining showed the cortical neuron cell, and TUNEL (red) staining showed the apoptotic cells.

Fig 6 Comparison of TUNEL staining positive cells of different experimental n=3)

**P<0.01vscontrol group,##P<0.01 MA group

本研究中，在MA給藥前2 h細(xì)胞用不同濃度的天麻素和MT分別預(yù)處理干預(yù)，再給藥MA作用24 h，發(fā)現(xiàn)天麻素和MT預(yù)處理后的神經(jīng)元細(xì)胞活力有不同程度改善。天麻素干預(yù)組天麻素濃度為25 mg·L-1時(shí)細(xì)胞活力改善較明顯；MT干預(yù)組MT濃度為10 μmol·L-1時(shí)細(xì)胞活力改善最明顯，與先前報(bào)道的研究結(jié)果相一致[13]。在細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)中，與對(duì)照組相比，MA組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞增多(P<0.01)；與MA組相比，天麻素組、MT組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞均減少(P<0.01)。與褪黑素組比較，天麻素組TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示天麻素對(duì)MA介導(dǎo)細(xì)胞凋亡起到保護(hù)作用，且作用效果與MT相當(dāng)。與對(duì)照組相比，MA組Caspase-3表達(dá)顯著增強(qiáng)，與先前的研究報(bào)道MA可以增強(qiáng)Caspase-3的活性表達(dá)結(jié)果一致[14]；經(jīng)天麻素預(yù)處理干預(yù)后，可減弱MA誘導(dǎo)的Caspase-3表達(dá)增強(qiáng)。

Fig 7 Effects of gastrodin and melatonin pre-treatment of 2 h on expression of caspase-3 in cortical neurons treated with MA for 24 h

A: Control group; B: 0.5 mmol·L-1MA group; C:GAS 25 mg·L-1+0.5mmol·L-1MA group; D: MA 10 μmol·L-1+0.5 mmol·L-1MA group. DAPI (blue) staining showed the nucleus, Tuj1 (green) staining showed the cortical neuron cell, and caspase-3 (red) staining showed the apoptotic cells.

結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道，我們初步分析天麻素對(duì)MA誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性的干預(yù)機(jī)制。課題組先前的研究結(jié)果表明，天麻素可以減弱MA誘導(dǎo)SH-SY5Y細(xì)胞的自噬，且這種機(jī)制可能與Akt/mTOR信號(hào)通路有關(guān)[5]。天麻素還可以通過(guò)降低大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，降低白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等炎性因子的表達(dá)改善MA導(dǎo)致的神經(jīng)功能損害[4]。此外，韓學(xué)超等[15]研究提示，天麻素可抑制心肌細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激損傷，最終通過(guò)減少凋亡來(lái)發(fā)揮一定的抗氧化應(yīng)激損傷的作用。但是確認(rèn)天麻素干預(yù)MA誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性損害機(jī)制是否與氧化應(yīng)激有關(guān)，需要更多的證據(jù)來(lái)證實(shí)。

MA介導(dǎo)的神經(jīng)毒性機(jī)制較為復(fù)雜，戒斷干預(yù)研究也尚在初期階段，本研究通過(guò)天麻素干預(yù)，發(fā)現(xiàn)天麻素對(duì)MA誘導(dǎo)的神經(jīng)元凋亡有明顯的改善作用，提示天麻素對(duì)MA誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性損害有一定的干預(yù)效果，具體作用機(jī)制有待深入研究。