慢性腎臟病血管鈣化機制及防治

黃雙宜

汕頭大學醫學院第二附屬醫院腎內科,廣東省汕頭市 515041

血管鈣化是動脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病血管病變、血管損傷、CKD和衰老等病癥中普遍存在的病理表現，是心腦血管疾病高發病率和高死亡率的重要因素之一。在CKD患者中，冠狀動脈鈣化及全身其他血管鈣化較普通人群更常見、更突出。CKD患者中血管鈣化的發生、發展更多的與其特有的危險因素參與相關，包括透析齡、高磷血癥、高鈣血癥、含鈣制劑的不適當使用、維生素D制劑不適當使用、繼發甲狀旁腺功能亢進、炎癥反應、氧化應激及尿毒癥毒素等，其中鈣磷代謝紊亂是關鍵因素。

1 CKD患者血管鈣化特點

在CKD患者群體中，既往認為血管鈣化主要發生在終末期腎病(End stage renal disease, ESRD)和透析患者中，但新近研究的動物模型顯示，CKD早期可發生血管鈣化，而且血管鈣化出現時間可能早于CKD第2期[1]。

血管鈣化可發生在血管壁的兩個區域，即血管內膜和中膜。研究發現CKD患者動脈中膜和內膜鈣化加速，這種鈣化在透析患者中發展迅速[2]。內膜鈣化與血脂異常有關，并與炎癥和內膜層增厚一起引起動脈粥樣硬化。這一過程在血管內壁上形成斑塊，斑塊不穩定，容易破裂。內膜鈣化容易導致血栓形成和閉塞性疾病。中膜由平滑肌細胞組成，由疏松的結締組織(主要是彈性蛋白)構成，中膜鈣化常繼發于糖尿病或CKD，這也可以稱為Monckeberg動脈硬化，特別是在沒有任何管腔狹窄的中膜鈣化的情況下。中膜鈣化導致血管僵硬、收縮性高血壓和左室肥厚。雖然CKD患者可以發展成兩種類型的血管鈣化，但中膜鈣化是CKD患者的特征性血管變化，且是在慢性腎病兒童患者中觀察到的血管鈣化的唯一形式[3]。

2 CKD患者血管鈣化機制

CKD患者鈣化的發展與長期高磷酸鹽血癥及短暫性高鈣血癥這種礦物代謝紊亂密切相關。重要的是，細胞外高水平的鈣磷礦化物質已被證明是介導血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cells，VSMCs)轉分化成骨/軟骨細胞表型的關鍵因素，促進VSMCs出現凋亡并產生基質小泡，表達骨相關蛋白，導致促進和抑制鈣化因子失衡，從而啟動以羥磷灰石聚集(晶核形成)和增長為特征的礦化過程，最終導致血管鈣化。

2.1 鈣和高磷酸鹽誘導鈣化細胞機制 臨床和流行病學研究一致表明循環中高水平的鈣離子和磷酸鹽對VSMCs有明顯的影響，他們的協同作用，特別是通過形成羥基磷灰石納米晶體，這會加速鈣化[4]。關鍵過程包括VSMCs骨軟骨細胞分化、凋亡、囊泡釋放和鈣化抑制劑水平的紊亂。VSMCs在高鈣、高磷酸鹽情況下發生類軟骨細胞分化。這些分化的類軟骨細胞下調平滑肌特異基因的產生，如平滑肌(SM)，α-肌動蛋白和SM22。同時，并上調骨軟骨生成的標志物，包括Runx2(cbfa1)、成骨相關轉錄因子(osterix)、骨橋蛋白(Osteopontin，OPN)、骨鈣素和堿性磷酸酶(ALP)。這些成骨細胞/軟骨細胞樣細胞失去其收縮特性，但能夠產生膠原基質，形成鈣、磷豐富的基質囊泡，能夠啟動血管壁的礦化。VSMCs的表型改變似乎是病理鈣化途徑中的一個重要步驟[5]。磷誘導的血管鈣化被認為是一種適應性的VSMCs從收縮型向成骨/軟骨型轉變。Runx2是一種轉錄因子，在成骨細胞和軟骨細胞分化中起重要作用，它誘導主要骨基質成分(包括Ⅰ型膠原、骨鈣素和OPN)的表達。VSMCs中Runx2的敲除可抑制成骨轉化和基質礦化。ALP是正常骨形成所必需的，被認為通過滅活礦化抑制劑焦磷酸鹽和磷酸化骨橋蛋白(P-OPN)來調節血管基質礦化，同時釋放游離磷[6]。

血清磷酸鹽升高促進血管基質鈣化的另一機制是通過刺激血管平滑肌細胞凋亡。生長停滯特異基因6(Growth arrest-specific gene 6)的表達下調可能是一個重要的潛在機制。在磷誘導的人主動脈VSMCs鈣化過程中，生長抑制特異基因6及其受體Axl的表達均降低[7]。生長抑制特異基因6抗凋亡作用通過Bcl2介導的磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B途徑實現；磷酸化使Bcl2失活并激活促凋亡蛋白Bcl2相關的死亡啟動子，導致caspase-3活化和凋亡。

高鈣血癥增加血管鈣化的風險，體外證據也強烈支持鈣促進血管平滑肌細胞鈣化[8]。兩項關鍵研究證明了當把鈣單獨加入人血管平滑肌細胞培養基時，促進礦化。而且，當鈣和磷加入培養基后，它們在協同誘導礦化[8]。利用離體血管環的進一步研究表明，對于給定的鈣磷產物，鈣升高比磷升高更能誘導血管平滑肌細胞鈣化[6]。鈣在誘導細胞凋亡和羥基磷灰石基質囊泡的形成和釋放中起著關鍵作用，而羥基磷灰石基質囊泡又形成礦物成核位點，促進進一步鈣化[9]。正如高鈣水平促進骨基質囊泡鈣化一樣，細胞溶質高鈣水平可以改變血管平滑肌細胞衍生基質囊泡的內在特性并誘導其鈣化。高鈣水平導致膜聯蛋白6-磷脂酰絲氨酸形成核復合物，增強基質金屬蛋白酶-2活性，從而導致彈性蛋白降解和鈣化。更重要的是，VSMCs暴露在高鈣水平下最終會耗盡內源性基質囊泡中的鈣化抑制因子γ-羧基谷氨酸基質蛋白MGP；當胎球蛋白A(Fetuin-A，FA)水平也降低時，如透析患者一樣，囊泡中含有預成型的結晶羥基磷灰石，或具有礦化能力，從而促進進一步鈣化[10]。

2.2 成纖維細胞生長因子23(Fibroblast growth factor 23，FGF23)/α-Klotho 最近在慢性腎臟病礦物質和骨異常(Chronic kidney disease-mineral and bone disorder，CKD-MBD)領域發現的兩個與磷酸鹽穩態相關的新參與者，即成纖維細胞生長因子(FGF23)和α-Klotho[11]。FGF23主要由骨中骨細胞產生的磷脂激素，FGF23的合成和分泌調節尚未闡明。但FGF23的水平可受到磷、鈣、VitD衍生物、甲狀旁腺素(PTH)和其他因素的影響。FGF23與成纖維細胞生長因子受體(Fibroblast growth factor receptors，FGFRs)1c、3c和4結合，在直接調節血清磷酸鹽(Pi)水平中起主要作用。在腎臟近端小管中，它通過下調鈉依賴性Pi協同轉運蛋白，Pi Ⅱa和ⅡC，從而增加腎臟Pi排泄[12]。另外，FGF23抑制1羥化酶并增加24羥化酶活性，從而降低1,25-二羥基VitD(骨化三醇)生成，也有利于血清Pi維持正常水平。此外，FGF23對甲狀旁腺中的甲狀旁腺激素合成負性調節[13]。綜合來看，FGF23的功能在于維持正常的血清Pi水平。

FGF23與FGFRs結合需要Ⅰ型跨膜蛋白α-Klotho作為一種必需的共受體。由于FGFRs的廣泛表達，細胞上的α-Klotho被認為賦予了FGF23作用的組織特異性。由于α-Klotho 主要在腎臟、甲狀旁腺和脈絡叢中表達，既往認為FGF23的功能僅限于這些器官，越來越多的證據表明FGF23可能具有其他受體和靶組織，包括心臟[14]。在CKD中FGF23水平升高與腎功能不全和礦物代謝異常有關。然而，FGF23對血管鈣化的潛在影響是有爭議的。

α-Klotho基因和蛋白質最早于1997年被發現，隨后被證明可以調節小鼠的壽命[15]。α-Klotho缺乏小鼠表現出高循環Pi和高骨化三醇的水平和動脈中層鈣化的發展，幾乎與在FGF23基因敲除小鼠中觀察到的結果一致[16]。這些結果證實了FGF23和α-Klotho都協調了礦物穩態。事實上，α-klotho水平在CKD的人和動物模型中出現下降，被認為加速CKD-MBD的進展[17]。已鑒定出兩種形式的α-klotho：膜結合α-klotho和可溶性α-klotho?？扇艿摩?klotho是由膜結合的α-klotho的胞外區脫落到循環中而產生的，它像激素分泌一樣可以在遠程的部點起作用。迄今為止的所有實驗都表明α-klotho對血管鈣化有保護作用。Hu等人報道了CKD小鼠病理模型α-klotho缺乏引起血管鈣化，可溶性α-klotho可抑制Pi的鈉依賴性攝取和Pi誘導的大鼠血管平滑肌鈣化[18]。這些結果提示α-klotho的可溶性和膜結合形式是CKD中治療血管鈣化的潛在靶點。

2.3 維生素D在血管鈣化中的作用 VitD受體激活劑(Vitamin D receptor activators，VDRAs)是治療CKD繼發性甲狀旁腺功能亢進的常用藥物，但其對血管系統的影響仍有相關爭議。VSMCs表達VitD受體，并具有功能性的1-α-羥化酶和25-羥化酶系統，因此VitD代謝物可以自分泌/旁分泌的方式被VSMCs利用。VDRAs促進鈣化通過上調Runx2(cbfa1)、成骨相關轉錄因子(osterix)、和骨鈣素[19]，并增加鈣轉運入血管平滑肌細胞中。然而，其他研究表明，維生素D通過增加鈣化抑制蛋白如基質γ-羧基谷氨酸基蛋白(Matrix Gla protein，MGP)和骨橋蛋白，減少促炎癥細胞因子，如IL-6、IL-1β和TGF-β[20]，對防止鈣化具有保護作用。重要的是，FGF23可以下調腎臟1-羥化酶受體表達，從而減少VitD的產生[21]，表明復合物FGF23-klotho與VitD在血管系統鈣化中有復雜相互作用。臨床和體外研究表明，VitD水平與血管測量可能存在雙峰關聯，因此低水平和高水平的VitD都與異常血管效應相關，還需要進一步研究以確定血管健康的最佳VDRAs及其最佳劑量[22]。故臨床需嚴格控制VitD用量和鈣攝入量，監測尿鈣水平以防鈣的異位沉著。

2.4 GRP(Gla-rich protein)、鈣蛋白顆粒(Calciprotein particles，CPPs)與細胞外囊泡(Extracellular Vesicles，EVs)的關系及在CKD中血管鈣化作用 FA是目前發現的最強有力的血管鈣化抑制物，它能直接與羥磷灰石晶體結合，防止羥磷灰石結晶增長，也可與鈣磷結合防止鈣磷沉積，有效的抑制異位鈣化的作用。FA是肝細胞合成的急性負時相反應蛋白，CKD患者體內的炎癥狀態導致FA下降，加重血管鈣化。MGP是由軟骨細胞和VSMCs產生的血管鈣化抑制因子。MGP抑制血管鈣化的機制與FA相似。

在循環中發現一種FA-礦物復合物，也被稱為CPPs，主要由鈣和磷礦物、FA和鈣調節蛋白組成，可能是防止異位礦化的重要機制。這種可溶性CPPs所含有的FA和其他蛋白可被視為具有穩定、運輸和循環血液中水不溶性礦物作用的礦物伴侶[23]。

EVs是一種由多種細胞分泌的，內含核酸、蛋白質等的脂質雙分子層。大多數細胞釋放的EVs最終可以到達血液循環系統，除了在生理或病理鈣化的開始中所起的重要的作用外(主要通過外泌體、微囊泡、凋亡小體、遷移小體等機制)，EVs被認為是細胞間通訊的主導者，因為它能夠將其內部介質轉移到受體細胞，從而影響和改變其正常功能。

從健康人群和CKD患者中分離出生物CPPs和EVs，并用超微結構、分析、分子和免疫技術進行比較。結果表明，GRP是循環中CPPs和Evs的組成部分[24]。CKD 5期患者血清CPPs和EVs的特征是FA和GRP水平較低[24]。CKD 5期中CPPs的礦物質成熟度增加，類似于次級CPP顆粒。血管平滑肌細胞鈣化試驗表明，CKD 5期中的CPPs、EVs被血管平滑肌細胞吸收，通過促進細胞骨軟骨分化和炎癥反應誘導血管鈣化[24]。將CKD5期的CPPs與γ-羧基化的GRP孵育后，血管鈣化效應得以緩解。Holt等人發現在體外，γ-羧基化GRP、FA和MGP的存在大大降低了堿性磷酸鈣晶體的形成和成熟，并在體內鑒定出類似的抗礦化體系[25]。循環中CPPs和EVs是CKD中血管鈣化的決定因素，通過分化和炎癥應激狀態調節VSMCs反應，導致礦物質沉積增加。在此過程中，GRP和FA水平的降低促進了CPPs和EVs的血管鈣化作用。從生物標記物的角度來看，Viegas等人的研究結果預見EVs和CPPs在CKD診斷中的巨大應用潛力，特別是通過測定其GRP和FA含量，以提高γ-羧基化GRP生物利用度為目標可能是治療血管鈣化相關疾病的有效的途徑[24]。

3 CKD患者血管鈣化的防治

CKD患者血管鈣化呈快速進展趨勢，即呈現出一個循序漸進過程，很難逆轉。綜上所述，對CKD中血管鈣化機制分析，血管鈣化目前尚無有效的治療方法,重點在于CKD早期防治。諸多危險因素參與血管鈣化的發生和發展，除了從控制血壓、糖尿病、血脂紊亂、營養不良、肥胖、吸煙等傳統因素，應著重從防治高磷血癥，避免高鈣血癥，防治繼發性甲狀旁腺功能亢進或低下，合理應用維生素D及類似物，防治礦物質代謝失調[26]。未來隨著對CKD中血管鈣化機制的深入研究,對潛在作用機制的探討，可能出現新的CKD中血管鈣化的治療方法。