肝素納米藥物的研究進展*

孫佳靜，萬江陵，楊祥良，李子福

(1.華中科技大學生命科學與技術學院，武漢 430074；2.國家納米藥物工程技術研究中心，武漢 430074)

近年來，納米技術不斷革新與發展，在醫藥領域展現出廣闊的應用前景[1]。由此衍生的納米藥物因具有更長的血液循環時間、緩控釋放以及低毒副作用等顯著優點而成為研究熱點領域[2]。但納米藥物仍存在遞送局限性，面臨著腫瘤深部滲透困難且易在肝臟、脾臟等組織中聚集產生器官毒性等問題[3]。肝素是一種高度硫酸化、非均一的天然糖胺聚糖[4]，具有良好的生物相容性和親水性，在臨床上常用作抗凝血藥物。肝素分子內富含可供進一步修飾的羥基和羧基，易于合成多功能兩親性衍生物。肝素及其衍生物可通過靜電吸附或化學鍵合等方式對納米藥物進行表面修飾，從而提高藥物的穩定性、水溶性，延長體內循環時間；也可作為納米藥物的骨架材料，實現對疏水性藥物、蛋白質和基因治療藥物的有效遞送。

肝素主要分為普通肝素(unfractionated heparin，UFH)、低分子肝素(low molecular weight heparin，LMWH)以及一些改性肝素。相較于UFH， LMWH具有更長的半衰期、更好的皮下注射生物利用度以及良好的藥動學行為[5]，因此在臨床上有更為廣泛的應用。肝素具有多種藥理學功能[6]，①抗凝血作用：肝素的戊糖結構與抗凝血酶Ⅲ結合后，通過抑制凝血酶與凝血活性因子的活性實現抗凝作用[7]。②抗血栓作用：通過抑制血小板聚集，并促進組織纖溶酶原激活因子的釋放與纖維蛋白的溶解[8]，從而減少血栓的形成。③抗炎作用：肝素能競爭性抑制硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和P-或L-選擇素之間的分子相互作用[9]，并下調趨化因子、轉錄因子[如核因子-κB(NF-κB)]和炎癥因子[腫瘤壞死因子(TNF-α)]的活性[10]，抑制炎癥細胞的黏附和組織浸潤。基于這些特性，肝素在臨床實踐中被廣泛用于各種適應證，這使得肝素納米藥物具備良好的臨床轉化潛能。此外，肝素還具有抗腫瘤血管新生和抗腫瘤轉移活性，并能與體內多種蛋白質結合而具有潛在靶向性。基于肝素構建多樣化的納米載藥系統，實現藥物的靶向遞送與協同抗腫瘤效果，以克服腫瘤多藥耐藥和免疫抑制等問題，有望用于黑色素瘤、肺癌、乳腺癌和胰腺癌等高轉移性腫瘤的治療。肝素優異的生物學特性使得其作為納米藥物載體材料具有廣闊前景。

1 肝素作為納米藥物載體材料的優勢

天然多糖具有安全性高、穩定性好和可降解等特點，且易于化學修飾與改性，如肝素、殼聚糖、透明質酸和羥乙基淀粉等，被廣泛用于納米載藥系統的構建。然而，殼聚糖水溶性較差，經聚乙二醇親水改性后又會造成藥物的細胞攝取減少和降解困難等問題[11]；透明質酸雖能提高藥物對腫瘤細胞的選擇性[12]，但易在肝腎部位聚集而產生毒副作用；羥乙基淀粉和肝素都具有良好的親水性和生物相容性，但肝素還具有其獨特的天然優勢：①抑制血管生成介導的抗腫瘤活性；②抗腫瘤轉移活性；③腫瘤靶向性。

1.1抗腫瘤活性 腫瘤的生長與發展依賴于異常的血管生成系統。血管生成由多種生長因子共同調節，例如血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、堿性成纖維細胞生長因子(Basic fibroblast growth factor，bFGF)和血小板衍生生長因子(platelet derived growth factor，PDGF)。這些生長因子與存在于內皮細胞和細胞外基質的硫酸乙酰肝素蛋白聚糖(heparan sulfate proteoglycans，HSPGs)結合，促進內皮細胞的增殖和遷移。肝素(尤其是LMWH)通過肝素結合域和多種生長因子相結合[13]，競爭性抑制生長因子與其內皮受體的結合，從而減少bFGF和VEGF誘導的血管生成，發揮抗腫瘤活性。

熊果酸(ursolic acid，UA)、藤黃酸(gambogic acid，GA)、槲皮素(quercetin ，Qu)等天然產物具有廣泛的抗血管生成活性，但水溶性差和不穩定性限制了它們的應用。通過化學偶聯將肝素與這些抗血管生成藥物相結合[14-16]，能產生協同效應，提高藥物的抗血管生成活性與抑瘤效果。TIAN等[17]以LyP-1肽為靶向配體，開發了LyP-1-LMWH-Qu(PLQ)偶聯物用于包封和輸送GA。該系統將多種抗癌藥物靶向共遞送至過表達p32的腫瘤細胞和腫瘤周圍淋巴管，實現靶向化療與抗血管生成治療的聯合，為逆轉乳腺癌的多藥耐藥和轉移提供了協同策略。

1.2抗腫瘤轉移活性 VEGF-C及其受體VEGFR-3對調控淋巴管生成有重要作用[18]，兩者結合后產生的信號級聯反應能誘導淋巴管生成、淋巴管內皮細胞的增殖、遷移和管狀形成[19]。肝素可以通過阻斷VEGF-C信號通路來抑制淋巴管生成，從而降低腫瘤轉移發生率。此外，肝素與P-和L-選擇素有良好的親和力，因此能競爭性抑制選擇素與相關配體的結合，從而抑制選擇素介導的腫瘤細胞與血小板的粘附，減少腫瘤細胞的轉移與侵襲[20]。肝素還能破壞腫瘤細胞肌動蛋白應激纖維的組織，并阻礙血小板與腫瘤細胞的相互作用，從而阻礙血小板誘導的上皮間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，抑制腫瘤的轉移[21]。

LONG等[22]構建了苯硼酸(PBA)-低分子量肝素(LMWH)-生育酚琥珀酸酯(TOS)自遞送納米膠束(PLT NPs)，用于抑制腫瘤轉移級聯的不同位點。體內試驗表明，未載藥膠束在黑色素瘤、乳腺癌及結腸癌轉移模型中都顯示出極強的抗轉移作用，而載阿霉素膠束在PBA的靶向作用下具有更強的抗腫瘤及轉移作用，有望成為術前及術后預防和治療腫瘤轉移的有效療法。后續的研究證明，該膠束中的親水段LMWH可以通過抑制P-選擇素及其配體介導的血管內皮細胞與粒細胞樣髓源抑制性細胞 (G-MDSCs)之間的粘附，阻斷G-MDSCs的外滲與早期肺聚集，從而防止轉移前微環境的形成，發揮抗腫瘤轉移作用[23]。

1.3腫瘤靶向性 肝素與腫瘤部位豐富的的血管內皮細胞和血管生長因子具有較強的親和力，因此肝素及其衍生物具有天然的腫瘤靶向性，有利于藥物在腫瘤部位的富集。HU等[24]采用脂質體融合技術制備了米托蒽醌(MTO)-潑尼松龍(PLP)共包載脂質體，再利用低分子肝素-脫氧膽酸偶聯物(LHD)作為靶向配體。實驗表明，LHD增強了藥物在體內的腫瘤靶向性，使得該脂質體在黑色素瘤和結腸癌模型中表現出更好的抑瘤作用。

2 肝素用于納米藥物的表面修飾

肝素是一種帶有負電荷的內源性多糖，可通過靜電吸附或化學鍵合等方式對納米藥物進行表面修飾，從而發揮以下作用：①提高藥物的水溶性；②抑制蛋白調理，減少網狀內皮系統(reticuloendothelial system，RES)的吞噬，延長藥物在體內的循環時間；③屏蔽納米粒的正電荷，阻止顆粒聚集，提高納米粒的穩定性并降低毒性；④肝素具有抗凝、抗腫瘤生長及轉移活性，能協同多種治療組分發揮更強的抑瘤效果。

2.1用作成像對比劑的穩定劑 超順磁性氧化鐵納米粒(superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPION)比表面積大、分散性好，是磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)中常見的對比劑，但其在生理環境下及磁場中易發生聚集，滯留于正常組織中造成長期毒性。利用肝素對其進行表面修飾后，能提高對比劑的穩定性和對比強度，降低毒性。

肝素及其衍生物修飾的SPION主要用于T2加權MRI。相比于右旋糖酐、殼聚糖修飾的SPION，肝素因能與細胞外基質環境中含有肝素結合域的各種蛋白質相互作用，而提高了納米粒的細胞攝取。XIE等[25]先將肝素與琥珀酸酐進行酰化反應，再涂覆于SPION表面制得SU-HP-SPION，其T2弛豫率(460 mM-1·s-1)為臨床Feridex?(98.3 mM-1· s-1)的4.68倍，在異種移植瘤T2MRI中的性能相比合成的Feridex類似物提高了10倍，并表現出良好的合成再現性、溶液穩定性和生物相容性。SPION的涂層厚度和親水性會影響r2值。因此，需對肝素進行適當修飾獲得更豐富的且能柔性連接的羧基，以取代SPION中疏水性表面配體實現兩者的緊密結合，得到高效低毒的成像對比劑。

由于胰島細胞的磁共振敏感性極差，其體內評估困難，且胰島移植早期即刻經血液介導的炎癥反應(IBMIR)會造成胰島功能的損傷。利用具有抗凝活性的肝素對成像對比劑進行修飾可有效解決上述問題。HWANG等[26]制備了具有抗凝活性的肝素固定化超順磁性氧化鐵(HSPIO)納米顆粒，用于體外胰島細胞的表面修飾。實驗結果表明，HSPIO納米粒能成功標記胰島細胞，并產生足夠的信號強度，且不會通過非特異結合而蓄積在肝臟中，實現對移植到體內的胰島細胞安全準確的定量檢測。將磁共振敏感的HSPIO納米顆粒穩定附著在胰島細胞表面，能減弱注射胰島細胞周圍的IBMIR，提高移植胰島細胞的存活率。肝素修飾的SPION在移植胰島細胞成像方面有廣闊的開發前景。

2.2用作陽離子載藥系統的穩定劑 陽離子脂質體被廣泛用于基因傳遞，但其會改變細胞膜電位、破壞細胞膜而產生細胞毒性。當陽離子脂質體進入血液循環時，它們與血液中帶負電荷的血漿蛋白結合，導致聚集和沉淀。借助靜電吸附作用完成肝素對陽離子載藥系統的表面修飾，能屏蔽納米粒的正電荷，提高納米藥物的穩定性。YU等[27]設計了一種LMWH包被的脂質siRNA復合物(LH-Lip/siBCL-2)來裝載BCL-2siRNA。實驗表明，LMWH的修飾顯著減少了由陽離子脂質體引發的正常細胞的凋亡和壞死，且外部肝素易被肝素酶降解，從而減小siRNA轉染的阻力。

此外，多肽、蛋白質等生物分子可通過自組裝形成結構可調的納米載體，可高效負載并遞送疏水性藥物與光敏劑。其中，陽離子肽分子如二苯丙氨酸二肽因其組裝形式多樣且易化學修飾而被廣泛應用。應用肝素對該陽離子納米載體進行修飾后[28]，有助于抑制體內蛋白吸附，延長納米粒的循環時間，是光敏劑的理想載藥平臺。

2.3用于聯合治療 常規化療不能充分抑制腫瘤轉移，且多次給藥可能導致全身毒性和耐藥。而將化療與免疫療法相聯合，同時利用有抗腫瘤轉移活性的肝素對納米粒進行修飾，能實現對腫瘤生長和轉移的有效抑制。XIA等[29]以PEG-PAMAM為骨架材料負載藥物DOX，再通過靜電作用在其表面吸附以免疫佐劑CpG-ODNs和LMWH，形成了一個核殼結構的納米遞送系統。肝素通過影響腫瘤細胞中肌動蛋白的排列和抑制血小板誘導的腫瘤細胞EMT而表現出抗腫瘤轉移作用，動物實驗表明該納米粒對原發性黑色素瘤及肺轉移有明顯的治療效果，這為抑制腫瘤轉移提供了有效的聯合治療思路。

3 肝素作為納米藥物的載體骨架

肝素是一種水溶性天然陰離子多糖，具有良好的生物相容性，且與多種蛋白質有較強親和力，因此可作為骨架材料用于藥物載體的構建，實現對疏水性藥物、蛋白質、基因等生物治療分子的有效遞送。此外，肝素分子中存在大量的游離羥基、羧基和硫酸根，可用于連接各類功能分子，豐富納米粒的功能。

3.1肝素-藥物偶聯物 肝素可用于構建可生物降解的兩親性多糖-藥物偶聯物，并自組裝形成具有內核結構的核殼納米粒，作為疏水藥物的貯存器。MEI等[30]通過腙鍵將肝素與DOX偶聯得到的兩親性HD-DOX具有酸響應釋藥特性并能在水中自組裝形成核/殼結構。其半衰期為游離阿霉素的3.6倍，對黑色素瘤的轉移具有明顯的抑制作用。

肝素及LWMH羧基的疏水衍生化能極大提高肝素的抗血管生成活性，同時降低抗凝活性，減少出血風險[31]。阿霉素(DOX)和DNA堿基對間的π-π相互作用使得兩者具有良好的親和力。基于DNA的結構，YU等[32]構建了線粒體損傷KLA肽衍生物(mKLA)和抗血管生成LMWH-白楊素偶聯物(LC)以模擬與DOX結合的雙鏈，三者在水性環境中通過π-π堆積、疏水作用和靜電作用，自組裝形成穩定的納米復合物LKD。DOX在多種超分子驅動力作用下“主動”載入納米粒內核，載藥量為一般DOX納米制劑的3倍。該復合物進入腫瘤細胞后，DOX的質子化作用會“解鎖”LKD，并通過抗血管生成、線粒體和DNA損傷的協同作用達到極強的抗腫瘤效果。

3.2納米凝膠 納米凝膠的網狀結構有利于載體對藥物的負載。肝素與帶正電的生物活性物質具有較好的親和力，能極大提高納米凝膠對生物藥物的負載效率。肝素與聚乙烯亞胺(PEI)通過化學交聯制得納米凝膠在基因治療方面取得良好成果。SONG等[33]利用細胞穿膜肽R8接枝的PEI與肝素合成的納米凝膠(HPR)可高效遞送基因質粒phTRAIL。該系統通過抑制腫瘤細胞增殖，促進細胞凋亡達到治療效果，在轉移性結腸癌模型中表現出良好的抗腫瘤活性。此外，肝素的屏蔽作用使其在保證高基因轉染效率的同時，毒副作用大幅減少。

肝素也常與普朗尼克通過物理或化學交聯以制備熱敏性的納米凝膠，用于負載治療性蛋白質以及疏水性藥物。LI等[34]將LMWH-普朗尼克共聚物與硅酸鹽納米粒子結合，制備了一種載DOX的熱敏性水凝膠LR-HP。該納米凝膠載藥量高，具有緩釋效果，且基于肝素和藥物的協同作用，其在體內外均表現出優異的抗腫瘤作用，適用于局灶性腫瘤的治療。

3.3聚電解質納米復合物 聚陰離子肝素可自發地與聚陽離子物質發生相互作用而形成聚電解質復合物，用于不同理化性質藥物的共遞送。此外，該類納米載體易實現電荷反轉，有利于藥物的細胞攝取和腫瘤部位的深部穿透。HUANG等[35]開發了一種酶響應納米粒。通過肝素和魚精蛋白之間的靜電作用制備了聚電解質復合物，合成了PTX-DOTAP@alloferon-1-肝素/魚精蛋白納米系統，以實現疏水性藥物PTX和親水性allereron-1多肽的共包載，粒徑為106.1 nm，Zeta電位為-45.1 mV。到達腫瘤部位后，細胞外基質中高表達的乙酰肝素酶-1識別并降解外層肝素并通過離子擴散作用釋放包裹的alloferon-1，使納米粒的粒徑減小至59.30 nm，電荷變為25.4 mV。實驗表明，該復合物對黑色素瘤具有良好的治療效果，且不會引發對正常臟器的毒副作用。該納米載藥系統將化療與免疫治療相結合，共遞送且逐步釋放alloferon-1和PTX使其作用于不同靶細胞，解決了依次給藥導致的腫瘤部位藥物/蛋白質比例不可預測、半衰期短和全身不良反應等問題，為高轉移性腫瘤的治療提供了一個良好的納米平臺技術。

基于肝素的聚電解質納米復合物也可用于核酸的高效遞送與可控釋放。NIE等[36]設計了一種具有核酸自促釋放功能的納米復合物Hep@PGEA，其中可解鎖的負電性肝素納米核(HepNP)由交聯硫辛酸修飾的肝素制得，并通過靜電作用與主-客組裝引入陽離子聚合物PGEA層。該復合物進入細胞后，肝素納米粒核心被解鎖并與外層PGEA相互作用，促進殼層中縮合核酸的釋放，有效地將miR-499和pVEGF導入心臟，抑制心肌細胞死亡，促進心臟修復。

4 結束語

肝素是一種可生物降解的聚陰離子天然多糖，具有優良的親水性、生物相容性，且含有多個可修飾位點，因此可作為表面修飾分子或載體骨架用于納米遞送系統的構建。肝素還具備抗腫瘤血管生成活性、抗腫瘤轉移活性和腫瘤靶向性等得天獨厚的優勢，使得肝素納米藥物極具發展潛力：①基于肝素及其衍生物構建納米藥物遞送體系，通過共價結合、靜電吸附等方式負載抗癌藥物，或是將其與免疫制劑聯用，可實現治療組分腫瘤殺傷作用與肝素抗血管生成作用相協同的抗腫瘤效果，這為克服腫瘤多藥耐藥及癌細胞轉移等問題提供了思路。②肝素分子內存在大量的羥基和羧基，易于修飾。通過pH敏感的腙鍵將肝素與藥物相連，可實現智能響應釋藥；或是連接以熒光基團、光敏劑、靶向基團等功能分子，可實現藥物的靶向遞送、實時監測以及多種治療方法的聯合，提高治療效果。③肝素帶有負電荷，可以與帶正電的蛋白質通過靜電作用結合為納米粒，或是與陽離子脂質相作用形成聚電解質納米載體，從而運載蛋白質、基因等生物藥物。基于此，可構建電荷反轉和粒徑變化的智能納米藥物，以實現藥物在腫瘤部位的深部穿透。④肝素可被在惡性、高轉移性腫瘤中高表達的乙酰肝素酶-1識別和降解，且肝素所具有的抗轉移活性，使得肝素納米藥物對于黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌等高轉移性腫瘤有著顯著的治療效果，在以上這些腫瘤的治療中具有極大的潛能。

盡管肝素在納米藥物遞送系統中發揮著越來越重要的作用，但目前尚無肝素納米藥物制劑進入臨床試驗。在肝素納米藥物的后續開發中，需要關注以下問題：①肝素有抗凝活性，因此可能誘發血小板減少癥，造成出血風險。然而肝素結構與活性之間的確切關系還不夠清晰，應對此進行深入研究。②納米粒通常經胞吞進入細胞，相比小分子藥物自由擴散的入胞方式，其細胞攝取效率較低。且肝素具有強的負電性，雖能延長藥物在血液中的循環時間，但與細胞表面的負電荷互相排斥，會進一步降低藥物的入胞效率。采用電荷反轉與受體介導等策略，可以提高納米藥物的入胞效率。③異常的血管、淋巴管結構，致密的間隙基質，高間質液體壓力，累積的固體應力等使得納米藥物向腫瘤核心的遞送和滲透異常困難。通過將肝素分子內可修飾的基團與腫瘤靶向配體(如苯硼酸、葉酸、乳糖酸)及降解細胞外基質的蛋白酶(菠蘿蛋白酶)等相連接，增強藥物在腫瘤部位的滲透。④動物來源的肝素生產工藝復雜，質量控制難度大。需采取有效的監測方法以分析和控制肝素的質量，并開發新工藝制備肝素，保證肝素的安全性。而肝素納米藥物在臨床轉化上還存在工藝放大困難、體內安全性評價復雜性等問題[37]，需要建立更科學全面的藥理、毒理學評價方法和質量評價指標。