生物力納米腫瘤學的研究進展*

曾浩文，楊祥良，2，李子福，2

(1.華中科技大學生命科學與技術學院，武漢 430074；2.國家納米藥物工程技術研究中心，武漢 430074)

近年來，隨著納米技術的快速發展[1]，結合多模納米成像技術、原子力顯微鏡表征技術、微/納尺度光刻加工技術所發展的納米探針從組織、細胞乃至分子水平深入揭示腫瘤力學微環境演化；另一方面，新型納米操作子通過對腫瘤組織或細胞進行力學干預實現腫瘤殺傷。納米技術應用于腫瘤力學生物學所取得的突破提示生物力納米腫瘤學作為一個新的學術方向逐漸形成。生物力納米腫瘤學旨在運用納米技術最新進展，結合力學和工程學的原理和方法，從基因、蛋白質到細胞、組織、器官乃至整體多層面研究腫瘤力學微環境及其調控的相關機制，為腫瘤的早期診斷、精準治療提供新的原理和方法。腫瘤組織與腫瘤細胞涉及的生物力一般介于皮牛(pN)至納牛(nN)級別，作用范圍在納米(nm)至微米(μm)尺度，常規檢測技術很難實現精準測量，而納米技術在腫瘤力學生物學上具備其他技術無法比擬的優勢。本文擬總結生物力納米探針與生物力納米操作子最新研究進展，討論生物力納米腫瘤學所面臨的挑戰，并展望其未來發展方向。

1 生物力納米探針

生物力納米探針指能測定腫瘤組織或腫瘤細胞力學性能的納米探針，生物力納米探針分為兩類：①可主動對腫瘤組織或細胞施加機械力，通過檢測腫瘤組織或細胞受力后的反應測得腫瘤組織或細胞的力學性能；②不能主動對腫瘤組織或細胞施加機械力，但可以在腫瘤組織或細胞產生的機械力作用下產生變形，進而反推出腫瘤組織或細胞力。

1.1腫瘤組織力學性能檢測 腫瘤組織異常的力學性能主要體現在“三高”：高腫瘤組織硬度、高間質液體壓力和高固體應力(solid stress)[2]。腫瘤組織硬度表征的是腫瘤組織對彈性變形的阻力，液體壓力主要來源于腫瘤間質液體施加的壓力，而固體應力主要來源于腫瘤組織內腫瘤細胞、間質細胞以及細胞外基質(extracellular matrix，ECM)等固體成分[3]。檢測腫瘤組織固體應力有以下3種方法：①將腫瘤塊對半切開，腫瘤切面在殘余固體應力驅使下變形：向外凸出意味著局部壓縮力，而向內凹陷意味著局部張力；②將腫瘤切成薄片，殘余的固體應力使腫瘤片在三維空間變形，此方法尤其適用固體應力小的轉移灶；③利用芯針活檢釋放固體應力，該方法能原位檢測腫瘤內部固體應力，同時離體測量癌旁組織對腫瘤組織施加的固體應力[4]。上述方法原理相同：先以可控的方式人為釋放腫瘤內固體應力，然后利用超聲成像技術重構切面形變并結合有限元理論計算出腫瘤組織固體應力[5]。然而，這種侵入式腫瘤固體應力測量會對機體造成損傷，借助臨床現有檢測儀器和技術，如磁共振彈性成像、超聲彈性成像或超聲橫波彈性成像，新型納米探針有望以無損的方式測定惡性實體瘤固體應力。發展能夠活體、原位、實時、無損檢測腫瘤固體應力的納米探針對于闡明腫瘤轉移、復發及藥物治療中腫瘤力學微環境的演化過程具有重要意義。

組織硬化是乳腺癌、肝癌等惡性實體瘤臨床觸診的理論依據。不同于腫瘤固體應力的測量，生物力納米探針在腫瘤組織硬度測量已經有重要應用。利用壓電材料鋯鈦酸鉛制備的兩種生物力納米探針提高了腫瘤針刺活檢取樣成功率[6]。第一種可獨立工作直接用于針刺活檢，第二種則可以加載到臨床使用的穿刺針針頭。二者均能直接對接觸對象施加一定應力(σ)，通過測量接觸對象在給定應力下的應變(ε)可以測得接觸部位的彈性模量(E=σ/ε)。對于臨床肝癌樣本，這兩種納米探針通過測定彈性模量能夠區分腫瘤組織(19～25 kPa)與癌旁肝硬化組織(9～11 kPa)。然而，鋯鈦酸鉛生物力納米探針在臨床應用上具有其局限性，要求操作人員預先得知取樣目標的彈性模量，另一方面，腫瘤細胞彈性模量的異質性會使探針無法區分開腫瘤細胞與正常細胞。借助原子力顯微鏡探針測得正常乳腺組織和良性乳腺腫瘤的楊氏模量(Young's modulus)分布均一，均值分別為1.1 kPa和3.7 kPa。然而惡性乳腺癌的楊氏模量存在三個峰值，分別為0.6，2.0和5.8 kPa[7]。楊氏模量為0.6 kPa的部位為腫瘤細胞，而5.8 kPa對應硬化的ECM。該研究表明，軟的力學微環境促進腫瘤進展及轉移，這與文獻[8-10]報道的研究結論相悖。盡管當前無法確定腫瘤的發展及轉移究竟需要軟的力學微環境還是硬的力學微環境，生物力納米探針在這些研究中的作用不可或缺。

1.2腫瘤細胞力學性能檢測 腫瘤細胞力學性能異常主要體現在三方面：低細胞硬度、高牽引力和低力學性能感知。利用原子力顯微鏡檢測細胞楊氏模量已有較多報道[7，11]，相關研究進展已經有系統性總結[12]。此外，細胞機械性能的檢測方法也已有介紹[13]。當前新型生物力納米探針在腫瘤細胞力學性能檢測方面的研究進展如下。

1993年，WANG等[14]發明磁力扭曲儀，其作用原理是通過4 μm磁球對細胞施加一定應力，同時檢測在應力作用下細胞產生的應變，最終由應力和應變的比值計算出細胞彈性模量[15]。利用磁力扭曲儀測得經力學篩選方法得到的腫瘤干細胞彈性模量為50 Pa，而相應的腫瘤細胞彈性模量為200 Pa[16]。此外，多電極磁鑷已被用來檢測人膀胱癌T24細胞的楊氏模量[17]。由于700 nm磁球可通過細胞攝取進入細胞內部，多電極磁鑷能夠精準測定胞內細胞質楊氏模量。利用多電極磁鑷測得的腫瘤細胞長軸楊氏模量為1.5 kPa，而短軸僅為1.1 kPa，兩者之間存在顯著性差異。磁力扭曲儀和磁鑷技術都可以通過改變磁場強度調控磁球對細胞施加的機械力，包括力的大小、方向以及頻率。新型生物力納米探針可以揭示傳統檢測手段無法探測的細胞內部機械性能。上述細胞力學性能檢測手段均依賴于外源性納米探針。盡管布里淵顯微鏡可不依賴外源性納米探針直接測量腫瘤細胞和多細胞球體彈性模量[18-19]，但是該方法在活體腫瘤組織中的應用面臨挑戰。

牛頓第三定律指出，對于一個作用力，都存在一個大小相等、方向相反的反作用力，遵循這一定律，腫瘤細胞將產生作用力，簡稱細胞力(cell generated force)，以響應周圍力學微環境的改變并維持力學穩態[20]。當前生物力納米探針主要通過直接或間接地測定細胞力作用導致的形變，從而實現對細胞力的測量。牽引力顯微鏡是目前應用最廣泛的測定方法[21]，其通過測定細胞力作用后的基質形變反算出細胞力[22]。該方法中基質形變的測定取決于熒光納米粒，熒光納米粒扮演生物力納米探針的角色。TAN等[23]改進了牽引力顯微鏡，制備了由聚二甲基硅氧烷(polydimethylsiloxane，PDMS)組成的彈性微柱生物力納米探針。PDMS柱在細胞力作用下會逐漸彎曲變形。通過測量微柱頂面在細胞力作用下的位移量，可以計算出單個微柱所受力的方向和大小，進而得到細胞力。然而，PDMS微柱之間相互獨立，細胞與柱表面不能完全接觸，并不能較好地模擬細胞原位微環境。利用DNA分子張力探針[24]，LIU 等[25]發現T細胞受體(T cell receptor，TCR)與抗原結合時需要12～19 pN機械力以激活下游信號通路。該生物力納米探針主要由修飾在金納米粒、熒光分子以及淬滅基團標記的DNA發夾組成[26]。當探針與T細胞結合力不足以打開DNA發夾時，熒光共振能量轉移以及納米金屬表面能轉移雙重淬滅機制會使熒光分子的熒光淬滅，探針不發出熒光[27]。當探針與TCR的結合力足以拉伸DNA發夾結構使熒光分子與淬滅基團及金納米顆粒分開時，探針的熒光會得到恢復并能反映TCR與抗原結合時所產生的機械力。分子張力納米探針時空分辨率高，能夠在單分子水平上測量細胞力，但該探針目前僅適用二維平面培養的細胞，難以在活體組織中應用。

腫瘤細胞的力學感知能力在增殖、遷移和侵襲等過程中起著重要作用。實體瘤內的細胞受多重機械力刺激，包括靜液壓力、剪切應力、壓應力、張力等[28]。腫瘤細胞通過細胞膜上的蛋白和細胞骨架網絡將感知的機械力信號轉換成生化信號，并進一步傳遞到細胞核內激活基因的表達。由于傳統表征手段無法測量腫瘤細胞力學感知能力，基于彈性基底材料的生物力納米探針在腫瘤細胞力學感知能力的研究上具有不可替代的作用。借助彈性基底生物力納米探針發現，乳腺肌上皮細胞對基底剛度的感知由不同類型整合素的鍵動力學決定[29]。α5β1整合素在細胞表面組成型表達(constitutively expressed)，αvβ6整合素在癌癥的發生和發展中選擇性表達，研究提示整合素αvβ6可作為一種新的乳腺癌治療靶標。此外，腫瘤細胞和正常細胞的剛度感知能力存在顯著差異[30]。在不同軟硬的PDMS柱上培養腫瘤細胞，并對細胞的剛度感知單位(contractile units，CUs)進行檢測發現，由于細胞骨架蛋白水平的改變，腫瘤細胞在不同剛度PDMS柱上無法產生足夠數量的CUs感知剛度刺激，并產生異常的生長信號。細胞骨架蛋白恢復正常水平，可以重新使腫瘤細胞獲得剛度感知能力，進而抑制腫瘤形成。研究腫瘤細胞的機械感知能力對于揭示腫瘤細胞與細胞之間、細胞與基質之間的相互作用機制具有重要意義。

2 生物力納米操作子

生物力納米操作子為能夠對腫瘤組織或腫瘤細胞進行力學調控的納米顆?；蚱骷?。生物力納米操作子分為兩類，一類通過調控腫瘤組織力學微環境中的組成成分從而改善腫瘤力學微環境，該類生物力納米操作子不具備主動施加機械力的能力；另一類可以對腫瘤組織或腫瘤細胞施加機械力，激活力學信號通路，最終決定腫瘤組織或細胞存亡。

2.1腫瘤組織力學調控 實體瘤異常力學微環境是納米藥物遞送過程的主要屏障之一，其導致納米藥物在腫瘤部位分布不均—靠近腫瘤血管部位納米藥物蓄積量高而遠離腫瘤血管部位納米藥物蓄積量低?；煵蛔愕奈：υ谂R床已多有報道。本課題組在細胞、斑馬魚以及小鼠中證實非均質分布納米藥物導致腫瘤細胞上調轉化生長因子β分泌量，加速腫瘤細胞上皮間質轉化進程，促進腫瘤細胞侵襲與轉移[31]。在此，筆者闡述生物力納米操作子在調控腫瘤力學微環境，提高藥物遞送效率及腫瘤殺傷效果中的應用。粒徑220 nm負載靶向賴氨酸氧化酶抗體的聚乳酸-羥基乙酸共聚物納米粒在4T1小鼠乳腺癌模型中證實，該生物力納米操縱子可以顯著降低腫瘤細胞外基質的量并破壞其致密結構，最終抑制腫瘤的生長[32]。粒徑19 nm鐵磁性納米粒在交變磁場的作用下可以使腫瘤溫度提高至42 ℃，從而破壞膠原纖維。這使得納米藥物更容易穿透腫瘤組織，取得良好的抑瘤效果[33]。粒徑100 nm包載膠原酶的脂質體可保護膠原酶在血液循環過程不會被蛋白酶降解。富集在腫瘤部位的膠原酶通過降解胰腺癌組織中的膠原纖維，提高包載紫杉醇脂質體腫瘤穿透能力及抗腫瘤療效[34]。盡管上述生物力納米操縱子可以顯著減少膠原纖維，但是腫瘤組織的力學性能未能得到測定。研究腫瘤力學性能與腫瘤細胞外基質以及藥物遞送之間的關系對發展新型生物力納米操作子具有重要價值[35]。此外，腫瘤缺氧微環境與腫瘤組織中纖維沉積密切相關，本課題組證實高壓氧治療提高腫瘤組織中氧含量，抑制HIF-1α/CTGF/ Collagen-1通路的激活，降低腫瘤組織中膠原纖維沉積量，最終提高納米藥物脂質體阿霉素腫瘤富集量與抗腫瘤療效[36]。

2.2腫瘤細胞力學調控 近十年來，研究人員已經在單細胞層面報道了一些能夠對腫瘤細胞施加機械力的生物力納米操作子，并對其工作原理及生物醫學應用進行了總結[37-38]。根據生物力納米操縱子對細胞施加機械力后所產生的效果，可以將其細分為兩類：第一類僅激活細胞力學信號通路；第二類可以殺死腫瘤細胞。磁力扭曲儀中的微米磁球可作為一種激活細胞力學信號通路的生物力納米操作子[16]。結合三維細胞磁力扭曲儀和受激發射損耗納米顯微鏡交互超高分辨三維細胞磁力扭曲系統，研究人員首次在細胞內報道機械力可以直接拉伸染色質并上調基因轉錄[39]。近紅外光響應生物力納米操作子由金納米棒構成核層，聚異丙基丙酰胺水凝膠組成殼層，水凝膠外周修飾有可以和細胞表面的整合素結合的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(Arg-Gly-Asp，RGD)肽[40]。常溫時，聚異丙基丙酰胺水凝膠處于舒張狀態。在近紅外激光照射下，金納米棒將光能轉化為熱能，使聚異丙基丙酰胺高分子鏈受熱收縮，并同時拉動RGD以及細胞表面整合素，最終對細胞施加機械力。利用DNA生物力納米探針進一步測得每個RGD分子在收縮過程中對細胞產生了13～50 pN的機械力。微米磁球生物力納米操作子施加機械力的大小、方向及頻率可控，并且能夠進行高通量細胞操控與測量[41]。但是磁球自身的重力會影響細胞表面理化性質以及力學信號通路。近紅外光響應生物力納米操作子雖然有很高的時/空間精度，但是其施加的機械力大小、方向及頻率可控性有待進一步提高。

第二類生物力納米操作子主要通過施加機械力直接殺死腫瘤細胞。表面修飾靶向死亡受體4抗體的粒徑15 nm Zn0.4Fe2.6O4鐵磁性納米粒在磁場誘導下與死亡受體4結合并且聚集，從而激活下游凋亡通路，引起腫瘤細胞凋亡[42]。不施加磁場時，納米粒雖然與細胞表面死亡受體4結合但不聚集，因此不會引發下游凋亡通路。ZHANG等[43]制備出的生物力納米操作子和溶酶體結合后會在動態磁場發生器中旋轉運動，破壞溶酶體結構完整性，導致細胞凋亡。利用相似的工作原理，研究人員利用磁場誘導鐵磁性生物力納米操作子產生機械力殺死腦癌細胞[44-45]。鐵磁性納米粒在磁場作用下組裝為納米棒，并產生超過100 pN的機械力破壞腫瘤細胞細胞膜和溶酶體膜，造成腫瘤細胞程序性死亡和壞死[46]。此類生物力納米操作子主要通過施加磁力破壞細胞器或細胞膜的完整性，最終殺死腫瘤細胞，但其臨床有效性需要進一步驗證。MITCHELL等[47]將粒徑100 nm PLGA納米?；蛄?00 nm聚苯乙烯納米粒通過化學鍵偶聯到腫瘤細胞表面，制備了不依賴于磁力的生物力納米操作子。該生物力納米操作子能增強細胞膜局部受到的剪切力，進而顯著提高TRAIL蛋白對腫瘤細胞的殺傷效率。相比于磁場誘導產生的磁力，生物體內剪切力的可控性更差，因此，此類生物力納米操作子的臨床轉化面臨更大的挑戰。

3 結束語

腫瘤力學微環境與腫瘤發生發展、轉移復發以及治療息息相關，腫瘤力學生物學已經成為腫瘤生物學以及腫瘤臨床轉化醫學的研究熱點。傳統研究方法面臨諸多挑戰。近年來，納米技術的迅猛發展為腫瘤力學生物學的研究提供了可靠的研究手段與檢測方法。筆者提出生物力納米腫瘤學這一新的研究方向，并給出其明確定義，進一步凝練出生物力納米探針以及生物力納米操作子。通過實例展示生物力納米探針在檢測腫瘤組織力學性能和腫瘤細胞力學性能的具體應用。結合最新研究進展展示生物力納米操作子在調控腫瘤力學微環境和細胞力學性能兩方面的具體應用。筆者相信，對生物力納米探針與生物力納米操作子的深入研究將有助于揭示腫瘤異常力學微環境及其對腫瘤的發生、發展、轉移、復發及藥物治療的影響規律及機制，有望為惡性實體瘤早期診斷和精準治療帶來顛覆性理論和變革性技術。