川南山地黃牛瘤胃微生物多樣性分析方法

宜賓職業技術學院，四川宜賓644003

川南山地黃牛產于四川盆地南部邊緣山區，性情溫順，役力強，其體軀較小，體質緊湊結實，前驅開闊，胸深，肩峰較高，背腰較寬。四肢較高，毛色以黃色居多。放牧以天然牧草為主，補飼以當地主產的玉米等青粗飼料為主，舍飼以當地皇竹草、象草、黑麥草、農作物秸稈或其調制的青貯飼料、氨化飼料為主。反芻動物瘤胃是一個復雜的生態系統，包含了多種未知的微生物，按照Woese 等[1-2]的現代分類方法瘤胃微生物分屬細菌、古生菌（產甲烷菌）和真核生物（真菌和原蟲）3個域。瘤胃內的微生物數量巨大、種類繁多，主要包括原蟲（超過25屬，其數量為104～106個/mL）、真菌（103～105個真菌孢子/mL，6個屬）、細菌（200種，活菌數高達1 011個/mL）、古生菌（5個屬，7個種）和噬菌體（顆粒數可達107～109個/mL）等，它們的共同作用是降解植物的細胞壁。川南山地黃牛瘤胃內的微生物通過相互協同作用，將飼料快速降解轉化成動物所需的營養和能源物質，瘤胃功能的健康與否直接決定本身的健康，微生物對瘤胃的消化代謝十分重要。近年來，微生物多樣性的研究方法是一個相對熱門的話題，準確地分析測定微生物群體的類型和數量，對瘤胃消化代謝體系作用機理相當重要。本文就川南山地黃牛反芻動物瘤胃微生物多樣性分析方法進行簡述。

1 瘤胃微生物的傳統研究法

1.1 亨氏滾管法

亨氏滾管法是最常用的厭氧培養方法，該技術是應用于洋酒瘤胃厭氧微生物的一種厭氧培養技術，可用于微生物的分離和鑒定，也可用于活菌培養計數。可以獲得瘤胃微生物的特定生長因素、代謝產物等信息，掌握瘤胃細菌及真菌的數量。通過此培養技術可以研究瘤胃微生物的多樣性，但是還是存在局限性，反芻動物瘤胃微生物大多是厭氧菌，在試驗時保持絕對厭氧環境不容易做到，能純培養出的瘤胃微生物是有限的，而且工作量大，測定結果與實際存在偏差。

1.2 最大或然數計數法

根據菌種特點采取最大或然數法（MPN 法）用于一些特殊功能菌的計數，將待測樣品進行稀釋，稀釋到少量的稀釋液接種到新鮮培養基中沒有或極少出現生長繁殖[3]。MPN 法對液相和固相中的真菌均能可靠記數，對產生游動孢子少的厭氧真菌的記數更適用，但不能對微生物進行分離研究，導致結果過高地估計瘤胃菌群的數量。

2 瘤胃微生物的分子生物學研究法

2.1 變性梯度凝膠電泳（DGGE）

變性梯度凝膠電泳技術是不需要進行體外瘤胃微生物培養，直接利用微生物樣品中的DNA或RNA對微生物群體加以區別，快速、準確地鑒定微生物種群的核酸變異檢測的電泳技術[4]。容易鑒定出傳統方式難以培養的微生物種類，極少量微生物樣品經PCR擴增后，也可檢測分離得出，結果穩定、重復性好。可以利用DGGE技術以川南山地黃牛與國外肉牛品種的瘤胃微生物群體的基因組DNA為研究對象，來了解其瘤胃中各種微生物的多樣性。應用DGGE技術檢測堿基突變時，需依賴于測序技術。

2.2 溫度梯度凝膠電泳（TGGE）

TGGE是一種DNA指紋圖譜技術，常與PCR聚合酶鏈式反應的DNA擴增技術結合，基于DNA基因信息的現代分子生物學方法，利用不同分子在溫度改變下構象差別進行分離[5]。利用NDA及RNA對微生物遺傳特性進行表征，避免傳統的菌種分離，還可鑒定出無法利用傳統方法分離出來的菌種。TGGE可用于研究瘤胃微生物細菌群落或特殊種群的遺傳多樣性，而無需作進一步的細菌個體特征分析。當GC含量不同的堿基序列DNA雙鏈解鏈時需要不同的溶解溫值，DNA雙鏈一旦解鏈，其在凝膠中的電泳速度將會急劇下降，其遷移行為決定于其分子大小和電荷。不同長度的DNA片段能夠被區分開，但同樣長度的DNA片段在膠中的遷移行為一樣，因此不能被區分。當然，TGGE在用分子生物學方法分析微生物群落結構組成時，有很多偏差。不同細菌的基因組大小和核糖體RNA拷貝數不同；提取基因組總DNA時細胞的裂解效率不同；DNA提取和純化時有偏差；PCR擴增過程中有偏差。

2.3 宏基因組技術

采取16 SrDNA測序技術用來研究胃腸道細菌的生態和進化問題，此分析法是將PCR擴增的環境微生物樣品總DNA的rRNA片段(或其他標記基因)克隆進合適的載體，構建克隆文庫以分離不同的序列，然后對分離的序列采用測序技術或PCR/RFLP進行定性分析。建立了一種可同時分析細菌、古菌16SrRNA基因及原蟲18SrRNA基因、真菌核糖體間隔區基因的方法，避免對非目標DNA測序，分辨率較高。但因成本高，工作量大，分析時間長，不適合對微生物群落結構變化進行動態跟蹤研究。

2.4 熒光原位雜交（FISH）

熒光原位雜交在微生物系統發育、微生物診斷和環境微生物生態學研究中應用較多，生產中可用于未克隆基因或遺傳標記、染色體變異、基因突變、基因拷貝數變化的檢測。

FISH是將細胞原位雜交技術和熒光技術有機結合而形成的新技術，基本原理用已知的標記單鏈核酸為探針，按照堿基互補的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進行異性結合，形成可被檢測的雜交雙鏈核酸可用于已知基因或序列的染色體定位。FISH技術關鍵是核酸探針的制備，微生物樣品必須先經過打碎、離心、清洗等處理步驟，使微生物細胞與雜質分離、除去雜質、收集細胞[6]，然后對收集的樣品進行固定和預處理，保證探針順利進入與DNA或RNA雜交。測定過程中能保持細胞形態完整，細胞不被破壞，能真實反映反芻動物瘤胃環境下微生物的形態結構及分布狀態。此技術必須依賴寡聚核苷酸探針的特異性，易出現假陽性和假陰性結果，靈敏度低于PCR技術，只能針對某一已知的特定菌種，不適用于未知微生物菌種的鑒定。

2.5 末端限制性片段長度多態性（T-RFLP）

末端限制性片段長度多態性技術(T-RFLP)是以熒光標記引物PCR為基礎，根據末端限制性片段長度區分出微生物群體組成的一種微生物群體圖譜法，可以定性與定量分析微生物群落。T-RFLP技術以分子系統學原理為基礎，綜合運用了PCR、限制性酶切、熒光標記和DNA序列分析等技術，通過對特定核酸片段長度多態性的測定來分析微生物群落結構和功能[7]。T-RFLP技術不需要培養的微生物群落，恰好彌補了絕大多數瘤胃微生物不可培養缺點，具有分析面廣、分辨率高、重復性好、快速簡便等優點。T-RFLP技術是將不同的細菌種群經一個特定引物—酶組合處理后，可產生相同的末端限制性長度片段，依賴于使用限制性內切酶來檢測16S rRNA基因的序列多態性，可能不只對應一個菌種，造成對群落多樣性的低估和對復雜群落多樣性的低估。

2.6 基因芯片技術

基因芯片又稱生物芯片，基因芯片技術是基于核酸互補雜交原理研制的新一代的核酸雜交技術，根據雜交信號進行定性與定量分析，具有高密度、平行分析、雙色測定和低背景值等特點，廣泛應用于復雜的微生物群落全面的和定量的研究。在微生物群落與多樣性研究中，多采用寡核苷酸芯片、群落基因組芯片及宏基因芯片，可以了解微生物在環境中的功能活動和對群落的特定功能進行定性。因為基因芯片能夠同時平行分析數萬個基因，進行高通量篩選與檢測分析，解決了傳統核酸印跡雜交技術操作復雜、自動化程度低、檢測目的分子數量少等不足。

3 結 語

川南山地黃牛是典型的地方牛品種，對四川、重慶偏南部山區的氣候條件和較粗放的飼養管理，有良好的適應能力。在改善飼養管理的條件下，可向役肉兼用型發展。要養好川南山地黃牛，必須要先養好瘤胃微生物，對瘤胃微生物多樣性分析顯得尤為重要，可以充分發揮其生長性能，生產中可以根據需要選擇瘤胃微生物的傳統研究法、瘤胃微生物的分子生物學研究法。