UPLC-MS/MS在中藥材農殘分析中的應用

孫仟，林林，郭東曉，林永強

(1.山東中醫藥大學，山東 濟南 250355；2.山東省食品藥品檢驗研究院，國家藥品監督管理局膠類產品質量評價重點實驗室，山東 濟南 250101)

隨著中藥材市場的擴大，野生中藥材已經難以適應當前的市場環境，中藥材生產依賴栽培種植已是大勢所趨。農藥能在相當程度上減輕病、蟲、草害對中藥材產量及質量的影響，大量的栽培種植就必然涉及農藥的使用。農藥殘留是使用農藥后殘存于生物體、農副產品和環境中的微量農藥原體、有毒代謝物、降解物和雜質的總稱[1]。在中藥材的栽培種植過程中所涉及的農藥多達幾百種，除常見的有機氯類、有機磷類、擬除蟲菊酯類和氨基甲酸酯類農藥外，鹵代烷類、氟制劑、取代苯類[2]、微生物制劑及激素類等農藥也有廣泛的使用。

目前對農藥殘留的監控以制定各個農藥的最高殘留限量和開發準確快速的定性定量方法為重點，隨著現代農藥檢測分析技術的發展，針對痕量多殘留的快速檢測已然成為現代農殘檢測研究的發展方向[3]。對于農藥殘留的檢測所使用的方法目前主要有薄層色譜法(TLC)、氣相色譜法(GC)、氣相色譜-質譜法(GC-MS)、高效液相色譜法(HPLC)、高效液相色譜-質譜聯用法(HPLC-MS)、超臨界流體色譜法(SFC)、毛細管區帶電泳法(CZE)和免疫分析法等[4]，不同的方法有各自的特點，本文重點論述的超高效液相色譜-串聯質譜技術(UPLC-MS/MS)是一項基于HPLC-MS/MS發展起來的分析技術。

HPLC-MS/MS在20世紀90年代就已發展成熟，此技術彌補了高效液相檢測器靈敏度不足的缺陷，以其選擇性高和檢測限低的優勢而成為現代實驗室日常使用的一種快速、準確的分析工具[5]。HPLC-MS/MS突破了HPLC檢測的局限性，在中藥材農殘檢測方面也得到了很好的應用和發展[6-8]，而UPLC釆用小粒徑填料色譜柱，配合超高壓系統，柱效更高，靈敏度更高，分析通量更大，并且其超強的分離能力有助于將目標化合物和競爭電離的雜質進行分離,從而減弱甚至克服MS檢測器因離子抑制而靈敏度降低的問題，使UPLC成為MS檢測器的最佳液相色譜入口[9]，而MS技術一向有高特異性和高靈敏度的突出優勢，兩項技術“強強聯手”的搭配，使UPLC-MS/MS展現出卓越的定性、定量分析能力及強抗干擾能力，十分適合中藥材農殘測定這類復雜樣本中的多種低含量目標物同時分析的情況。

本文將綜述UPLC-MS/MS在中藥材農殘分析中的應用現狀，對目前此技術聯用的關鍵步驟進行總結、介紹和比較，對基質效應的產生和應對方法進行分析，并展望了UPLC-MS/MS在中藥農殘檢測中的應用前景。

1 UPLC-MS/MS技術在中藥材農殘檢測研究中的應用

UPLC-MS/MS作為一項通用檢測技術，目前在檢測氨基甲酸酯類[10]、有機磷類[11]、擬除蟲菊酯類[12]、三嗪類除草劑[13]和新煙堿類殺蟲劑[14]等各類農藥過程中都取得了較為理想的結果，使用該技術檢測中藥材中農殘的試驗步驟基本由以下幾個方面依次展開，首先根據農藥的使用情況及具體試驗情況選擇出目標物；優化前處理方法，并根據目標特色進行提純凈化；選擇合適的色譜柱及洗脫程序分離樣本；優化質譜條件，進行穩定性、精密度、回收率等方法學驗證，最后對目標物進行高靈敏度的定性定量分析。以下也將以這樣的順序對UPLC-MS/MS在中藥材農殘分析中的應用現狀進行綜述和分析。

1.1 樣品前處理 樣品前處理是對樣品進行提取和除雜，獲得符合檢測要求的檢測樣本以進行定性、定量分析檢測的步驟。中藥材成分十分復雜，雜質干擾問題嚴重，農藥殘留濃度極低，合適的前處理方法能最大限度地去除干擾物，提取待測物，減少對檢測儀器的污染，精確定量，選擇的前處理方法是否合適將直接關系到試驗結果的成敗。目前，UPLC-MS/MS對中藥材中農藥多殘留分析使用的前處理技術主要有固相萃取技術(SPE)、分散固相萃取技術(DSPE)、基質固相萃取技術(MSPD)、溶劑萃取技術(SE)及凝膠滲透色譜技術(GPC)等。

DSPE技術又被稱為QuEChERS技術，此技術由美國農業部農業研究服務中心的 Anastassiades 等[15]于2003年開發，而后又于2005年引入了針對酸堿敏感農藥的右酸緩沖鹽體系[16]，此方法對大多數農藥均能進行較高質量的提取，已經成為世界各國殘留分析技術的模板[17]，亦是目前UPLC-MS/MS在檢測中藥材中農殘領域應用最多的一種前處理方法。其基本原理基于SPE技術,操作步驟可以簡單歸納為：①以純乙腈、含1%乙酸乙腈溶液或含水乙腈等對樣本進行初步的提取分離；②以氯化鈉、無水硫酸鎂或無水醋酸鈉等鹽進行鹽析、取上清；③加入乙二胺-N-丙基硅烷(PSA)、石墨炭黑分散固相萃取劑(GCB)等吸附劑填料吸附基質中的雜質對樣本進行凈化除雜；④離心、濾過，對上清液進行分析檢測[18]。此方法靈活性強，實驗人員可以根據具體的藥材及目標物的性質對提取劑，吸附劑及用量等條件進行變化調整，或與其他方法聯合使用，以取得最佳的試驗結果。

Wu等[19]使用酸性乙腈對補充過水分的人參樣品進行萃取，使用無水硫酸鎂吸收多余的水分，在對5種純化方案進行篩選后，采用了PSA(100 mg)+C18(100 mg)+GCB(50 mg)的搭配對樣本進行純化，在使用UPLC-MS/MS法同時檢測人參中27種農殘的試驗中取得了較基質固相萃取(MSPD)等方法更優的試驗結果。

Yang等[20]使用乙腈為萃取劑，對4種不同吸附組合的凈化效率和萃取回收率進行對比，采用了PSA(20 mg)+Al2O3-N(50 mg)+GCB(20 mg)組合吸附劑純化樣本，結合最適合于固體和半固體樣品的加速溶劑萃取技術(ASE)，研究了一種使用UPLC-MS/MS法分析甘草樣本中15種氨基甲酸酯類農藥殘留的新方法。試驗將此方法與液-液萃取法(LLE)、凝膠滲透色譜法(GPC)和固相萃取法(SPE)進行了比較，發現此方法有試驗時間短和試劑使用量少的優勢。

李家春等[21]使用含1% 醋酸的乙腈為萃取劑對含水量進行過調整的中藥材進行提取，以無水硫酸鎂及無水醋酸鈉進行鹽析，采用了無水硫酸鎂(360 mg)+PSA(60 mg)組合吸附劑對樣本進行純化除雜，結合UPLC-MS/MS為三七、川貝母、薏苡仁、桂枝和金銀花5種中藥材中的35種有機磷類農殘提供了快速檢測的方法。

還值得注意的一點是提取溶劑并不一定適合進樣，為優化出峰時間和峰形，往往需要再經試驗挑選出最適合的復溶溶劑。李娜等[22]在測定中草藥中氨基甲酸酯類農藥殘留量的試驗中將樣本以乙腈提取，丙酮-正己烷(20∶80)溶解，凈化后選擇流動相作為復溶液，以甲醇-0.1%甲酸(40∶60)進行復溶；而李娜等[23]在以UPLC-MS/MS測定黃芪中有機磷類農藥殘留量的試驗中同樣以乙腈為提取溶劑，但在對峰形，溶解度和響應值多方面考察后，定容溶劑選用了甲醇-0.1%甲酸(60∶40)進行定容。

1.2 色譜及質譜條件 在色譜方面，目前針對此領域的試驗多選擇C18色譜柱，再根據各類中藥材本身的性質及農殘類型的不同，使用甲醇-水體系或乙腈-水體系的流動相進行梯度洗脫，為了進一步改善峰形和提高靈敏度,流動相中往往會添加低濃度的甲酸、甲酸銨或乙酸銨等，一方面能起到抑制不穩定的弱酸或弱堿性農藥分解的作用，另一方面還能起到提高離子化效率的作用。

樣本中各成分經UPLC分離后進入MS系統，中藥材農殘的檢測目前最普遍的方法是使用三重四極桿質譜儀以多反應監測(MRM)方式對試驗樣品進行掃描。具體方法為首先對目標農藥的標準品溶液進行全掃描,得到一級質譜圖，確定母離子后再進行二級質譜全掃描，采集全掃描的二級質譜圖,找到兩個或兩個以上子離子進行定性和定量，最后，對碰撞能量、碰撞室出口電壓等質譜參數進行優化，調整靈敏度至最佳水平。

中藥材中基質復雜，試驗目的又多是同時檢測體系中多種含量極低的目標化合物，MRM模式可以有針對性地選擇數據進行質譜信號采集，靈敏度高，選擇性也高，十分適合于中藥材中檢測農殘，就目前所查資料，除考慮方法普適性，對單個反應監測模式(SIM)偶有應用[11]外，此類試驗幾乎均采用此模式檢測。三重四極桿質譜儀是進行單一質荷比掃描最靈敏的一類質譜系統，同時也最適合進行MRM分析，因此，此類試驗也多選用了此種搭配。

電噴霧電離源(ESI)的檢測限低，靈敏度高，應用范圍廣，成為UPLC-MS/MS檢測中藥農殘的優先之選，大量的試驗也證明了此類離子源十分適合農殘類痕量樣本的分析。

ESI源和大氣壓化學離子源(APCI)均為常用的噴霧型軟電離液質接口系統，不同的是ESI源的特點是主要適用于極性、大分子有機物，易形成多電荷離子，揮發或不揮發的溶質均可使用；而APCI源更多的適用于弱極性化合物及小分子有機物，能獲得良好的結構信息，有試驗比較二類離子源發現APCI源較ESI源受基質效應的影響更小，但在靈敏度方面APCI源較ESI源要低[24]，在適合類型的農殘檢測試驗中APCI源也是一項可供考慮的選擇。在查詢資料過程中還發現在食品中農殘分析領域對大氣壓下的閾值光電離源(APPI)也有應用,有研究以此離子源對氨基甲酸酯類農藥殘留進行了檢測，效果較為理想。APPI源的原理與APCI源類似,適用于檢測非極性化合物及低極性化合物，彌補了ESI源和APCI源都不適合的非極性化合物空缺，而且APPI源受基質效應的影響也比較小,還可以省去農殘檢測過程中基質校正的步驟,簡化試驗過程,擴大技術應用范圍[25]，但目前在近期針對中藥材領域的此類研究中沒有發現相關應用。

另外，由于目標物在正離子模式下更易形成穩定的分子離子峰，正離子模式采集普遍較負離子模式采集效果更優，故此類試驗鮮有使用負離子模式采集的例子，除少數試驗選擇了采用正負離子同時掃描的模式[26]外，都優先選擇了正離子模式進行測定。

吳國利等[27]使用UPLC-MS/MS對檳榔中的10種理化性質有較大差別的農藥殘留進行同時測定，選用Hypersil Gold C18色譜柱，以0.1%甲酸-乙腈為流動相進行梯度洗脫，在ESI模式下采用正離子模式以MRM方式進行數據采集，對20種市售的檳榔制品中的10種農殘進行了精確的檢測。

張玉婷等[28]采用UPLC-MS/MS對人參、黃芪中55種除草劑進行了同時測定，選用Acquity BEH C18色譜柱，同樣以0.1%甲酸-乙腈為流動相進行梯度洗脫，在ESI模式下采用正離子模式以MRM方式進行數據采集，建立了對人參、黃芪中12類除草劑殘留進行精確檢測的方法。

不難看出目前QuEChERS前處理加UPLC與三重四極桿質譜儀聯用幾乎成為UPLC-MS/MS進行中藥材中多農殘分析的常規方法，此方法有普遍適用性和高效性。在此方法之外，針對中藥材中農藥殘留的檢測也存在不同的嘗試。

Su等[11]使用多壁碳納米管等材料制成微型萃取膜，聯合溶劑萃取的方法對人參進行了前處理，采用UPLC、ESI源和四極軌道質譜儀在target-MS2模式下同時對人參中19種有機磷類農藥殘留進行了分析。不僅通過簡單有效的前處理過程一步完成了對分析物的提取和凈化，分析結果也獲得了較好的線性和回收率，是此類方法的一次成功應用范例。

2 基質效應

基質效應是指基質中的共提取物組分干擾對目標化合物的分析，產生基質增強作用或基質抑制作用，最終對分析結果的準確性產生影響。中藥材為復雜基質樣本，農殘含量低，基質效應尤為嚴重，在此類試驗中，基質效應是一項難以規避的問題。針對不同樣本不同程度的基質效應，使用的方法也不盡相同，目前在具體試驗中往往采用優化前處理方法，使用基質匹配標準溶液校正及同位素內標法補償等方法進行減弱或修正。

2016年，秦瑤等[29]應用UPLC-MS/MS測定生脈飲及其原料藥中的 19 種農殘，在計算基質效應后發現在生脈飲，麥冬，黨參中存在不同方向不同程度的基質增強和抑制效應，于是選擇用基質標準溶液對定量的結果進行校正，試驗結果符合多種農藥殘留的分析要求。

2013年，由于所測樣本組成范圍廣，難以獲得與樣品成分相似的空白樣品，Mao等[13]成功在不使用基質標準溶液校準的情況下，使用分子印跡聚合物(MIPs)作為選擇性固相萃取吸附劑，通過構建凝膠滲透色譜法(GPC)與分子印跡固相萃取技術(MISPE)相結合的方法對樣本進行前處理，使用UPLC-MS/MS對黃芪、人參、山藥、丹參、金銀花及馬錢子中的23種三嗪類農殘進行了分析。

2018年，林永強等[30]在以UPLC-MS/MS法測定瓜蔞中156種農藥殘留的試驗中，由于瓜蔞中油脂類成分含量較高，試驗結果受基質效應影響嚴重，使用QuEChERS 的方法凈化基質效應后結果不佳，最終選擇了以固相萃取技術(SPE)與QuEChERS 結合凈化的前處理方法，同時在試驗中采用了同位素內標加入的方法對基質效應進行了補償，最終取得了理想的試驗結果。

3 UPLC-MS/MS在中藥材中農殘檢測領域的研究展望

比較最近的三版《中國藥典》(2005年版、2010年版、2015年版)可以發現，我國在中藥安全性質量控制方面有十分明顯的完善，在新版《中國藥典》中已經收錄了農藥多殘留的檢測方法，我國已在不斷進步中與國際領先檢測管控比肩，雖有不足，但趨勢利好。

目前UPLC-MS/MS技術在各個領域已經得到了較為廣泛的應用，也越來越多地應用于對中藥材中農藥殘留進行分析，此技術尤其適用于復雜樣本體系中對多種目標化合物進行快速定量，分析效率極高，在提高檢測準確性的同時也極大地節約了時間和試劑成本，是一項適合目前應用要求，符合領域發展方向的技術。時至今日，此技術在中藥材中多農殘分析領域內的應用已趨于成熟，已經可以同時精確檢測中藥材中的百種農殘，但在查詢相關文獻過程中發現仍是存在新研究較少，基質效應問題難以克服的問題，且儀器成本較高，影響方法使用的普及性。相信隨著儀器的革新和更多的試驗經驗積累，UPLC-MS/MS技術將會更加充分的發揮它的獨特優勢輔助中藥農殘分析檢測的發展。

本文對近期相關應用進行了歸納，以期為UPLC-MS/MS技術檢測中藥材中多農殘的研究提供參考，輔助中藥材安全性研究及應用，使中藥材農殘檢測更規范，高效，環保。只有針對不同的農藥性質及限量，綜合中藥材本身性質選擇最佳的檢測方式進行檢測，輔助科學合理地制定用藥規范，限制中藥材的外源性污染，倒逼生產端合理使用農藥，才能達到減少環境污染，保證用藥安全的目的。