中藥橘核質量標準研究

趙勝斌

(汝州市人民醫院藥械科，河南 汝州 467500)

橘核為蕓香科植物橘及其栽培變種干燥成熟種子，在我國有悠久的藥用歷史，早在五代時期的本草專著《日華子本草》中就有其應用的相關記載[1]。該藥物味苦，平，無毒，主要用于治療膀胱氣痛、腎冷等，現代藥理學研究結果顯示橘核具有較強的鎮痛抗炎、抗腫瘤等作用[2-3]。對于橘核的質量標準從《中國藥典》1963年版至2015年版均有相關的記載，但目前橘核的質量標準仍以性狀及顯微鑒別為主，對其薄層色譜鑒別及含量測定等現代鑒別手段并無相關要求，已不能適應目前的用藥要求，因此有必要對其質量標準進行提高以進一步提高質量控制水平，規范其質量[4]。經過多年研究發現，橘核內生物活性成分以檸檬苦素、諾米林、黃柏酮為主，本研究擬采用高效液相色譜法對橘核中上述成分進行定量分析，以期為橘核的質量控制提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 儀器 采用美國安捷倫公司生產的1200型高效液相色譜儀(檢測器：DAD二極管陣列檢測器，色譜工作站為安捷倫公司專用工作站，四元梯度泵、柱溫箱、自動進樣器)。AUW220D型十萬分之一天平(日本島津公司)；BP121S萬分之一天平(德國賽多利斯公司)。

1.2 試藥 檸檬苦素對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110800-201707)；諾米林(赫澎生物上?？萍加邢薰?，批號:1063-77-0)；黃柏酮(中國食品藥品檢定研究院，批號：111923-201604)；乙腈、甲醇為色譜純購自德國默克化工技術有限公司，試驗用水為自制純化水。石油醚(60～90 ℃)、乙醚、乙醇、甲醇為分析純均購自天津四友精細化學品有限公司。橘核分別購自安徽亳州藥材市場、廣州清平藥材市場、廣西玉林藥材市場及河北安國藥材市場，均經汝州市藥品檢驗所弓西方副主任中藥師鑒定為蕓香科植物橘(CitrusreticulataBlanco)及其栽培變種的干燥成熟種子，詳見表1。

表1 橘核藥材來源

1.3 色譜條件 色譜柱：Agilent SB-C18(4.5 mm×250 mm,5 μm)，流動相乙腈-水(64∶36)等度洗脫，柱溫：30 ℃，檢測波長：210 nm，流速：1.0 mL·min-1，進樣量：10 μL。

1.4 溶液的制備

1.4.1 混合對照品溶液 精密稱取檸檬苦素、諾米林、黃柏酮對照品適量，分別置10 mL量瓶，加入甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得到含檸檬苦素、諾米林、黃柏酮對照品分別為0.99、1.01、0.98 mg·L-1的對照品儲備液，分別精密量取上述對照品儲備液各2 mL置入同一10 mL量瓶中并稀釋至刻度，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜濾過，得到檸檬苦素、諾米林、黃柏酮濃度分別為0.198、0.202、0.196 mg·L-1的混合對照品溶液。

1.4.2 供試品溶液的制備 精密稱取本品粉末0.5 g(過三號篩)，精密加入無水乙醇25 mL，超聲提取30 min，濾過、濾液蒸干，殘渣加甲醇溶解，置10 mL量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜濾過，得到供試品溶液。

2 結果

2.1 方法學考察

2.1.1 標準曲線的繪制 精密吸取“1.4.1”項下混合對照品溶液2、5、10、15、20 μL，分別按“1.3”項下色譜條件進行測定，記錄峰面積，以峰面積為Y軸，對照品進樣量為X軸進行線性回歸，得到檸檬苦素、諾米林、黃柏酮回歸方程，結果見表2。

表2 各對照品回歸方程及相關系數

2.1.2 精密度試驗 精密吸取“1.4.1”項下混合對照品溶液10 μL，按“1.3”項下色譜條件連續進行6次測定，記錄檸檬苦素、諾米林、黃柏酮峰面積，計算相對標準偏差(RSD)，檸檬苦素、諾米林、黃柏酮分別為0.65%、0.62%、0.37%。

2.1.3 重復性試驗 取6份3號樣品粉末，每份約0.5 g，精密稱定，按“1.4.2”項下供試品溶液制備方法制備成供試品溶液，以“1.3”項下條件進行含量測定，記錄檸檬苦素、諾米林、黃柏酮峰面積，計算RSD值分別為1.26%、1.09%和1.33%。

2.1.4 穩定性試驗 取3號樣品粉末約0.5 g，精密稱定，按“1.4.2”項下供試品溶液制備方法制備成供試品溶液，在配置后0、2、4、8、12、24 h后分別按“1.3”項下色譜條件進行含量測定，記錄檸檬苦素、諾米林、黃柏酮峰面積，計算RSD值分別為0.89%、1.27%、1.03%，提示24 h內供試品溶液穩定性良好。

2.1.5 定量限與檢測限考察 取“1.4.1”項下混合對照品溶液適量進行倍比稀釋，再“1.3”項下色譜條件連續進行6次進樣檢測，記錄峰記錄檸檬苦素、諾米林、黃柏酮峰面積。分別對定量限及檢測限進行計算，以信噪比為10∶1時為定量限，信噪比為3∶1時為檢測限，檸檬苦素、諾米林、黃柏酮定量限分別為1.07、1.34、1.48 ng；檸檬苦素、諾米林、黃柏酮檢測限分別為0.39、0.22、0.35 ng。

2.1.6 加樣回收率試驗 取已知含量的供試品(3號樣品)6份，各0.25 g，精密稱定，分別加入一定量的檸檬苦素、諾米林、黃柏酮對照品，分別按“1.4.2”項下供試品溶液制備方法制備成供試品溶液，以“1.3”項下條件進行含量測定，計算回收率，結果見表3。

表3 加樣回收率試驗結果

2.2 樣品含量測定結果 取11批樣品，“1.4.2”項下供試品溶液制備方法制備成供試品溶液，以“1.3”項下條件進行含量測定，分別計算各批次檸檬苦素、諾米林、黃柏酮質量分數(以干燥品計)，結果見表4。11批樣品中檸檬苦素、諾米林、黃柏酮平均質量分數分別為0.702%、0.412%、0.072%，以均值-20%為其限度標準，暫定為橘核中檸檬苦素、諾米林、黃柏酮含量不得低于0.56%、0.33%、0.06%。

表4 樣品含量測定結果

3 討論

3.1 供試品制備工藝的考察 制備工藝方面因橘核為種子類藥材，含有大量的脂肪油，因此考慮先對藥材進行脫脂處理，本研究先后對不脫脂無水乙醇超聲提取30 min、以石油醚(60～90 ℃)超聲脫脂處理30 min后棄去石油醚液再乙醇超聲30 min及乙醚超聲脫脂處理30 min后棄去乙醚液再乙醇超聲30 min，發現3種提取方法所提取的檸檬苦素、諾米林、黃柏酮得率RSD在3%以內，加上節能、減排的考慮，在提取前不做脫脂處理[5-6]。在提取方法上，本研究考察了超聲、回流及高速勻漿3種提取方法，發現超聲與回流提取所提取的檸檬苦素、諾米林、黃柏酮得率RSD在3%以內，故選擇超聲操作更為簡便，另外高速勻漿法雖然目標物得率有所提高，但因該方法所使用的高速勻漿儀目前國內實驗室普及率不高，考慮到標準的普適性暫未將該提取方法納入本標準中，將來待該儀器在國內實驗室普及率較高時可考慮使用高速勻漿法進行提取，該方法提取效率高、操作時間短，具有較明顯的優勢[7]。另外本研究還對提取時間、提取溶劑及料液比進行考察，提取時間方面考察了提取10、20、30、40、60 min，發現在提取30 min后各目標成分含量并無明顯上升，因此選擇30 min作為提取時間。提取溶劑方面考察了二氯甲烷、無水乙醇、甲醇，發現無水乙醇提取效率高且毒性小，料液比方面在1∶50時提取效率最高，隨后料液比升高目標物得率并無明顯上升。

3.2 檢測波長的確定 取檸檬苦素、諾米林、黃柏酮對照品溶液，以DAD檢測器進行全波長掃描結果發現檸檬苦素、諾米林、黃柏酮最大吸收峰波長分別為210、211、214 nm，分別選擇上述波長下色譜圖分析發現在210 nm時各色譜峰分離效果最佳，理論塔板數較高，故選作本次研究的測定波長。

3.3 流動相的選擇 流動相方面在查閱文獻[8-9]的基礎上本研究先對甲醇-水(62∶38)、乙腈-水(62∶38)進行對比發現乙腈-水系統色譜峰峰形更尖銳，理論塔板數更高，故選擇該系統進行優化，在乙腈-水(64∶36)時分離效果最佳，對照品及供試品均可在15 min完成檢測。另外本研究還對不同品牌液相色譜儀及色譜柱進行分析，結果顯示具有較高的重現性。

橘核具有理氣、散結、止痛的功效，臨床上常用于治療疝氣疼痛、睪丸疼痛等疾病，臨床應用較多[10]。但目前現行的《中國藥典》2015年版中橘核的指標標準僅收載性狀及顯微鑒別方法，對其含量并未作要求。本研究開發的中藥橘核中檸檬苦素、諾米林、黃柏酮高效液相色譜含量測定方法，操作簡便，重復性高，穩定性、精密性良好，可用于提高橘核質量評價。