阿膠口服液中粗多糖含量測定方法的研究

劉春霖，吳曉云，謝強勝，高天陽，董蓬

(山東省食品藥品檢驗研究院，山東省食品藥品安全檢測工程技術研究中心，山東 濟南 250101)

阿膠為馬科動物驢(EquusasinmL.)的干燥皮或鮮皮經煎煮、濃縮制成的固體膠。它是我國傳統的名貴補血中藥，具有補血滋陰，潤燥，止血，增強體質，增強免疫力等功效[1-3]。本次研究的阿膠口服液是以阿膠為主要原料，添加熟地黃、黨參、枸杞子、黃芪等中藥材，經提取、濃縮、配制、灌裝等主要工藝制成的產品，具有增強免疫力的保健功能。上述添加的中藥材均含有多糖類成分，文獻研究報道具有免疫調節、抗氧化、抗疲勞的作用[4-8]。近年來，很多學者對不同中藥材的粗多糖含量進行了研究[9-10]，但是針對阿膠口服液中粗多糖的研究還比較少。本研究采用沉淀蛋白質等前處理方法，使樣品中相對分子質量大于10 000的高分子物質與阿膠分離，然后在體積分數80%乙醇溶液中沉淀，與水溶液中單糖和低聚糖分離，用苯酚-硫酸反應，其呈色強度與溶液中糖的濃度成正比，在485 nm波長下比色測定粗多糖(以葡聚糖計)含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Mettler Toledo Ms十萬分之一電子天平(德國梅特勒公司)；恒溫水浴鍋(上海樹立儀器儀表有限公司)；TDZ5-WS離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)；XK96-B渦旋混合器(姜堰市新康醫療器械有限公司)；TU-1901紫外分光光度計(北京普析通用公司)。

1.2 試劑試藥 乙酸鋅、亞鐵氰化鉀、苯酚、無水乙醇、濃硫酸，分析純；水為去離子水；乙酸鋅溶液：稱取乙酸鋅[Zn(CH3COO)2·2H2O]21.9 g，加冰乙酸3 mL，加水溶解并稀釋至100 mL；亞鐵氰化鉀溶液：稱取亞鐵氰化鉀{K4[Fe(CN)6]·3H2O}10.6 g，加水溶解并稀釋至100 mL；80%(V/V)乙醇溶液：20 mL水中加入無水乙醇80 mL，混勻；苯酚溶液(50 g·L-1)：稱取精制苯酚5.0 g，加水溶解并稀釋至100 mL，混勻，備用。

葡聚糖標準品：相對分子量500 000，批號：BCBN7863V，購自Sigma公司。

葡聚糖標準儲備液：準確稱取干燥至恒重的葡聚糖對照品0.5 g，加水溶解，并定容至50 mL，混勻，置冰箱中保存。此溶液1 mL含葡聚糖10 mg。

葡聚糖標準使用液：吸取葡聚糖標準儲備液1.00 mL，置100 mL容量瓶中，加水至刻度，混勻，置冰箱中保存。此溶液1 mL含葡聚糖100 μg。

阿膠：某阿膠制品公司提供，和樣品來源為同一家公司。

樣品：某阿膠制品公司提供，3批編號分別為1、2、3。

2 方法與結果

2.1 標準曲線系列溶液制備 精密吸取葡聚糖標準使用液0.00、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20、1.40、1.60 mL(相當于葡聚糖0、10、20、40、60、80、100、120、140、160 μg)，分別置于25 mL比色管中，準確加水補充至2.0 mL，加入50 g·L-1苯酚溶液1.0 mL，在旋轉混合器上混勻，小心加入濃硫酸10.0 mL，于旋轉混合器上小心混勻，置沸水浴中煮沸2 min，冷卻后用分光光度計在485 nm波長處，以試劑空白為試驗參比，1 cm比色皿測定吸光度值。以葡聚糖濃度(μg)為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。

2.2 樣品溶液的制備

2.2.1 試樣沉淀蛋白質處理 取混合均勻的試樣15 mL，置250 mL容量瓶中，加水50 mL，緩慢加入乙酸鋅溶液5 mL和亞鐵氰化鉀溶液5 mL，加水至刻度，混勻，靜置30 min，用干燥濾紙過濾，取續濾液備用。

2.2.2 沉淀粗多糖 準確吸取上一步濾液5 mL，置于50 mL離心管中，加入無水乙醇20 mL，混勻，置4 ℃冰箱中冷藏過夜，以4 000 rpm離心30 min，棄去上清液，殘渣用體積分數80%乙醇溶液數毫升洗滌，以4 000 rpm離心15 min，離心后棄上清液，反復操作2次，殘渣用水溶解并定容至25 mL，混勻，此溶液為樣品測定液。

2.2.3 樣品測定 分別吸取2.0 mL樣品測定液置25 mL比色管中，加入50 g·L-1苯酚溶液1.0 mL，混勻，加入濃硫酸10.0 mL，混勻，密塞，沸水浴加熱2 min，立即冷卻至室溫得待測溶液。在485 nm波長處測定吸光度值。從標準曲線上查出葡聚糖的質量，計算，即得樣品粗多糖含量。

2.3 標準曲線回歸方程線性范圍 取標準曲線系列溶液進儀器測定，結果表明葡聚糖的標準溶液在10.8～172.8 μg范圍內具有良好的線性關系，相關系數為0.999 9，結果見表1。

表1 線性試驗結果

2.4 取樣量考察 分別量取同一批號的樣品5、10、15、25 mL各2份，按上述樣品溶液的制備方法制得待測溶液，測得葡聚糖含量分別為244.6、253.1、285.7、280.9 mg·(100 mL)-1，結果表明取樣量為15 mL時蛋白質沉淀完全，粗多糖沉淀量適當，樣品溶液吸光度值在標準曲線中段，所以確定15 mL為取樣量。

2.5 重復性考察 精密量取同一批號混合均勻的樣品6份，按上述方法制得待測溶液，比色測定后計算葡聚糖含量，結果6份樣品葡聚糖含量的RSD為1.4%，表明該方法重復性良好。

2.6 精密度考察 取制得的待測溶液，按上述方法連續測定6次吸光度，利用標準曲線計算葡聚糖含量，結果6次葡聚糖含量的RSD為0.11%，表明該方法精密度良好。

2.7 穩定性考察 取制得的待測溶液，按上述方法分別于比色后0、1、2、4 h測定吸光度，結果4次葡聚糖含量的RSD為0.96%，表明比色后供試品溶液在室溫條件下4 h內穩定。

2.8 回收率考察 精密量取同一批號混合均勻的樣品9份，分為3組濃度，每組濃度3份樣品，每組分別精密稱取葡聚糖對照品約18、22.5、27 mg，置250 mL容量瓶中，分別精密加入混勻的試樣7.5 mL，依法制備加標樣品。按上述方法進行測定，結果平均回收率在97.1%～100.1%，表明該方法回收率好，結果見表2。

表2 回收率試驗結果(n=3)

2.9 方法檢出限 參照GB/T 5009.1-2003《食品衛生檢驗方法理化部分總則》中附錄A.2.2規定，檢出限為3倍空白值的標準偏差(測定次數n≥20)相對應的質量，吸光法按國際理論與應用化學家聯合(IUPAC)規定。檢出限按下式進行計算：檢出限=Ks/b；b-標準曲線回歸方程中的斜率；s-20次空白值的標準偏差；K-一般為3，結果見表3。

表3 檢出限試驗結果

2.10 樣品測定

2.10.1 沉淀蛋白質方法 精密量取3批混合均勻的樣品15 mL，按上述方法進行測定，計算葡聚糖含量，結果見表4。

表4 沉淀蛋白質方法樣品測定結果

2.10.2 未沉淀蛋白質方法 按樣品企業標準規定的檢測方法，精密量取3批混合均勻的樣品5 mL，置于100 mL容量瓶中，加水80 mL左右，于沸水浴上加熱2 h，冷卻至室溫后補加水至100 mL刻度，混勻，過濾，棄去初濾液，收集續濾液供沉淀粗多糖。沉淀粗多糖及樣品測定等步驟均同“2.2”項下方法，結果見表5。

表5 未沉淀蛋白質方法樣品測定結果

由表4～5可知，未沉淀蛋白質方法比沉淀蛋白質方法測得的葡聚糖含量高約106 mg·(100 mL)-1，結果差異較大。為找到結果差異的原因，我們做了以下方面的研究。

2.11 含阿膠陰性空白對照溶液測定及比較 根據企業提供33 kg阿膠制成20 000支口服液(20 mL/支)的配方量，計算得口服液中阿膠濃度為82.5 mg·mL-1。為得到和樣品相同阿膠含量的陰性空白對照，本研究取阿膠，粉碎，過篩，精密稱定8.25 g，置100 mL量瓶中，加水80 mL，水浴煮沸溶解，冷卻，加水，定容至刻度，4 000 r·min-1，離心20 min，取上清液備用。

2.11.1 含阿膠沉淀蛋白質陰性空白溶液的制備 精密量取上述上清液15 mL，按“2.2”項下方法制得樣品測定液。

2.11.2 含阿膠未沉淀蛋白質陰性空白溶液的制備 精密量取上述上清液5 mL，按“2.10.2”項下方法制得樣品測定液。

將上述兩種樣品測定液按“2.2.3”項下方法進行測定，計算葡聚糖含量，結果見表6。

表6 含阿膠陰性空白對照溶液測定結果

由表6可知，阿膠中的蛋白質對粗多糖測定干擾顯著，未沉淀蛋白質的樣品溶液比沉淀蛋白質的樣品溶液測定結果高約91 mg·(100 mL)-1，這與表4～5兩種方法測定結果差值約106 mg·(100 mL)-1相吻合，驗證了本研究采用的沉淀蛋白質前處理方法，能夠有效去除阿膠口服液中蛋白質對粗多糖測定的嚴重干擾。

3 討論

3.1 本研究中阿膠口服液企業標準規定的粗多糖檢測方法有提取步驟，該操作是針對固體樣品的，且長時間沸水浴可能引起糖結構變化，甚至使碳鍵斷裂而導致所測多糖含量偏低。阿膠口服液是均勻澄清的液體，經驗證本法采用沉淀蛋白質的前處理可有效避免上述問題，且能夠有效去除蛋白質帶來的測定干擾。

3.2 比色法測定多糖并非特異性反應，出現測定結果平行偏差較大，所以試驗中沉淀、洗滌、棄上清液、樣液的轉移等操作都要嚴謹，實際操作時可增加平行樣的測定[11]。