GSDMD介導的細胞焦亡研究進展

葉淑敏，胡慶華

(中國藥科大學藥學院，江蘇 南京 211198)

2001年，一種不同于細胞凋亡的細胞死亡方式被發現，然后被定義為細胞焦亡[1]，2015年發現gasdermin D(GSDMD)作為細胞焦亡的下游蛋白發揮著重要作用[2]。炎癥小體激活后，切割半胱天冬氨酸(caspase-1/4/5/11)，切割后的成熟半胱天冬氨酸作用于GSDMD，形成的GSDMD-N端通過寡聚化會在細胞膜上形成孔洞，產生水分內流、細胞膜內外離子梯度消失，細胞發生腫脹、滲透性溶解最終導致破裂死亡。通過對細胞焦亡的形態特征、分子機制及其與相關疾病的深入研究，將有助于為相關疾病的診療提供新的防治策略。本文就近年來細胞焦亡的發生機制及其與相關疾病的關系進行研究與討論。

1 細胞焦亡與GSDMD之間的關系

細胞焦亡是近些年來的熱門研究之一，它是一種不同于細胞凋亡的細胞程序性死亡方式。細胞凋亡時的特征是細胞自主分解的程序化過程，不會將細胞的內容物釋放到細胞外，通常伴隨著細胞核固縮、核凝聚和核碎裂，及形成凋亡小體后被體內的吞噬細胞所吞噬[3]。然而細胞焦亡卻是一種不同于細胞凋亡的程序性死亡方式，它能引起細胞質膜迅速破裂，將細胞內容物釋放出去，包括一些促炎因子IL-1β、IL-18等[4]。

2015年，兩個不同的研究組將GSDMD確定為炎癥性半胱氨酸酶的直接靶標。Shi等[2]利用CRISPR-CAS9方法篩選出TLR4-/-骨髓巨噬細胞(BMDMs)依賴caspase-1的細胞焦亡和依賴caspase-11的細胞焦亡的基因，而Kayagaki等[5]建立了一個正向遺傳篩選，通過篩選可以耐受LPS誘導的乙基-N-亞硝基脲(ENU)突變小鼠的細胞焦亡的基因。這兩個組均確定了一個名為GSDMD的基因。同時，另一個研究組通過質譜發現，GSDMD為尼日利亞菌素誘導的NLRP3炎癥小體的關鍵成分[6]。

細胞焦亡的形態學特征是在細胞膜上形成孔洞，細胞膜失去完整性，膜的屏障功能消失，導致細胞發生溶脹破裂，但是細胞核依然保持完整。進一步研究表明，GSDMD與細胞膜上孔洞的生成有密切關系。GSDMD作為一個二聯蛋白，它包含一個30 kDa的N端結構域(GSDMD-N)和一個20 kDa的C端結構域(GSDMD-C)，該結構域包含保守序列“(F/L)L(S/T)D”，可被半胱氨酸蛋白酶識別[2,5-7]。識別并切割后，GSDMD-N端易位到質膜上，在負染色電子顯微鏡下，GSDMD-N端寡聚化后形成的膜孔內徑約為10～15 nm，孔的寬度足以允許成熟的IL-1β和IL-18通過[8]。當細胞膜上出現許多的膜孔之后，細胞膜的滲透壓出現失衡，質膜破裂，最終導致焦亡的發生[9-10]。GSDMD-N端能特異性識別酸性脂質，例如：磷脂酰肌醇磷酸酯(PIP)、磷脂酸(PA)和磷脂酰絲氨酸(PS)，GSDMD-NT與細胞膜相互作用，構成內部膜雙層的小葉[11-12]。研究顯示，GSDMD-N端也能結合一種特殊的脂質—心磷脂，這種脂質存在于細菌的質膜及線粒體內膜上，并且在體外實驗中，重組的GSDMD-NT顯示出對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和李斯特菌強大的殺滅能力，表明GSDMD在介導直接細菌殺傷免疫防御中具有潛在作用[8]。

2 細胞焦亡發生的分子機制

作為一個新的程序性死亡方式，細胞焦亡發生分為依賴caspase-1的經典途徑和依賴caspase-11、caspase-4/5的非經典途徑。細胞焦亡不僅在抗微生物感染中發揮作用，也與非病原性感染有一定關系，深入研究細胞焦亡有助于找到疾病新的治療靶標。

2.1 經典途徑 病原體微生物刺激人體后，細胞內模式識別受體(PRR)誘導寡聚，它們與凋亡相關的微粒蛋白和半胱天冬酶前體組裝在一起，形成炎癥復合物，該復合物可以識別病原相關分子模式(PAMPs)，例如：細菌、真菌、病毒等，而損傷相關分子模式(DAMPs)，例如：ATP和膽固醇，可以促進免疫細胞(巨噬細胞、樹突狀細胞)分泌IL-1β和IL-18，引起細胞焦亡[13]。在經典途徑中，細胞內PRR接收信號刺激，炎癥體開始組裝，形成的炎癥小體可以激活caspase-1前體，形成活性caspase-1。而活性caspase-1一方面能促進IL-1β和IL-18前體裂解，形成成熟的IL-1β和IL-18，另一方面也可以切割GSDMD形成GSDMD-N端和GSDMD-C端，GSDMD-N端能與真核細胞上的磷脂酰肌醇磷酸酯結合，形成孔洞后，細胞內部和外部的滲透壓失衡，導致細胞裂解死亡，同時成熟的IL-1β和IL-18釋放到細胞外，募集免疫細胞引發炎癥反應，最終形成細胞焦亡[14]。Caspase-1介導的細胞焦亡經典途徑是先天免疫中重要環節。

2.2 非經典途徑 小鼠caspase-11和人caspase-4/5可以誘導非經典細胞焦亡途徑。Caspase-11可以直接識別并結合LPS，作用于GSDMD并切割產生GSDMD-N端，促進細胞焦亡的發生[15-16]。Caspase-11還能激活pannexin-1通路，釋放ATP，促進膜通道P2X7的開放，誘導細胞焦亡的發生[17]。Caspase-11也能激活NLRP3和下游caspase-1，導致炎癥因子的釋放。Caspase-11/4/5非經典途徑可以通過控制GSDMD形成的孔洞調節鉀離子的釋放，從而與NLRP3-ASC-caspase-1途徑產生聯系，間接調控IL-1β和IL-18的釋放[5]。這種調控方式提示了經典途徑與非經典途徑之間能夠通過NLRP3炎癥小體來相互作用，相互轉化。

3 GSDMD抑制劑

Necrosulfonamide (NSA)是一種小分子化合物，它在體內和體外實驗中能直接抑制細胞焦亡所造成的膜孔的形成，及由吡啶、NLRP3和NLRC4炎癥小體導致的IL-1β的釋放。深入研究后發現，NSA能與GSDMD結合，抑制GSDMD-N端的寡聚，導致無法形成細胞膜孔從而阻止細胞出現細胞焦亡。NSA不會抑制GSDMD的二聚化，而是抑制二聚體的組裝。體外實驗表明，NSA以32 μmol·L-1的結合親和力結合在GSDMD蛋白上，在抑制炎癥體下游細胞焦亡發生的同時，保持其他通路例如TLR4信號轉導和GSDME介導的細胞死亡通路的完整性[18]。NSA作為一種小分子抑制劑，可以作為熒光探針更好地測量體外難以測定的GSDMD形成的膜孔，不僅對細胞焦亡的研究有著重要的意義，而且可以作為GSDMD介導的各種炎癥性疾病包括炎癥性腸病、炎癥性關節炎和敗血癥的靶標，為未來炎癥性療法的發展提供依據[18-19]。

4 GSDMD介導的細胞焦亡與疾病的關系

4.1 神經炎癥 中樞神經系統中，作為先天性免疫細胞的小膠質細胞參與細胞焦亡引發的炎癥反應。神經炎癥在急性創傷性脊髓損傷(SCI)的繼發性損傷中起關鍵作用，因此控制小膠質細胞的活化及炎癥反應時產生的炎癥因子可能會幫助SCI的治療[20]。在Dai等[21]的研究中發現，南藤蛇醇(celastrol)抑制SCI大鼠中焦亡相關蛋白NLRP3、ASC、caspase-1、GSDMD的表達，減少TNF-α、IL-1β、IL-8的釋放，同時抑制小膠質細胞焦亡的發生，減少小膠質細胞的活化和炎癥因子的釋放，從而減少脊髓損傷后的空腔區和神經元的丟失，減輕炎癥反應，促進大鼠神經功能的恢復。

4.2 肝臟缺血再灌注后的神經系統并發癥 肝臟缺血再灌注(HIRI)是許多肝臟手術中的重要的病理生理過程，它能引起炎癥因子、趨化因子及ROS的釋放，引起炎癥和氧化應激反應，并導致細胞死亡。有研究顯示，HIRI后神經系統并發癥的發生率約為20%，所以HIRI與神經系統并發癥之間可能存在一定聯系[22-23]。Zhang等[24-25]的研究顯示，NLRP3、caspase-1、ASC及GSDMD的表達在HIRI發生6 h后達到峰值，降低后在第三天又出現峰值，由此推測，HIRI產生的ROS可能激活海馬和皮質層的NLRP3炎癥小體導致炎癥的產生并出現神經元損傷。最近的研究表明N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體亞基2A(NR2A)通過Src-PSD95-NR2A途徑在HIRI引起的海馬損傷和認知障礙中發揮了關鍵作用，通過使用NLRP3選擇性抑制劑MCC590，可以在一定程度上改善HIRI引起的神經元NLRP3表達水平升高和焦亡的發生。

4.3 腎損傷 急性腎損傷(AKI)作為一種嚴重的臨床并發癥，會導致腎功能快速下降和高臨床死亡率，其中腎小管細胞死亡是作為一種重要的組織病理學標志[25-26]。Caspase-11在腎小管上皮細胞發生損傷時出現上調，能在順鉑或者是缺血再灌注造成的AKI所引起的GSDMD的切割中發揮作用。Caspase-11基因敲除小鼠中，用順鉑處理的小鼠明顯腎損傷減弱，腎小管的損害減少，并且IL-18的釋放減少。同時，在caspase-11下游底物GSDMD基因敲除小鼠中也能發現順鉑誘導的腎臟形態和功能的惡化得到一定程度的緩解，也能明顯抑制IL-18的釋放，從而調節中性粒細胞和巨噬細胞浸潤，達到緩解AKI的作用[27]。

4.4 動脈粥樣硬化 高脂飲食會導致血管壁中脂質的積累促進動脈粥樣硬化的發生，繼而導致炎癥、動脈結構改變和細胞死亡，而血管平滑肌細胞(VSMC)中的細胞死亡，可引發斑塊形成并加劇動脈粥樣硬化發展[28-29]。氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)是動脈粥樣硬化的主要危險因素，Pan等[30]在VSMC中，發現ox-LDL能促進AIM2和GSDMD-NT的表達。進一步研究發現，AIM2過表達能增加ApoE基因敲除小鼠的GSDMD活性和DNA片段化。體外實驗中，AIM2表達的增加加速了細胞焦亡的發生，而在VSMC中抑制AIM2的表達可以減少細胞焦亡，并且AIM2可以通過VSMC中的ASC，capase-1途徑促進GSDMD-NT的表達。

4.5 糖尿病腎病 糖尿病腎病(DN)是糖尿病的常見并發癥，特征是腎小管基底膜和腎小球膜增厚，腎小球細胞增殖和細胞外基質積聚[31-32]。研究顯示，炎癥發生導致的巨噬細胞的浸潤與DKD的發病有一定的關系，NLRP3/caspase-1/IL-1β途徑的激活發生在DKD的早期。Wang等[33]在體內和體外高糖條件下發現，caspase-1、GSDMD、IL-1β的表達增加，抑制TLR4/NF-kB信號通路的傳導可以逆轉這種情況，說明TLR4/NF-kB信號轉導參與了DN中腎小管細胞的細胞焦亡。

4.6 急性肺損傷 急性肺損傷(ALI)是膿毒癥的常見并發癥，特點是肺出現不可控制的炎癥反應。雖然在ALI在近期取得很大進展，但是依舊沒有有效藥物能治療ALI[34]。據報道，二氫楊梅素(DHM)能夠抑制血管內皮細胞的NLRP3炎癥小體的活化來發揮抗炎作用。Wang等[35]的研究顯示DHM能治療CLP引起的嚴重肺損傷，治療顯著降低了CLP誘導的肺組織病理損傷，炎性細胞浸潤，總細胞和中性粒細胞數以及總和蛋白質和白蛋白濃度，減輕NLRP3/ASC/caspase-1/IL-1β，同時也能減少GSDMD和GSDMD-N端的生成，在CLP誘導的ALI中起保護作用。有研究顯示，Ac-YVAD-CMK，一種特定的caspase-1抑制劑，可以預防肺泡巨噬細胞焦亡產生的損傷。根據這些研究顯示，抑制NLRP3炎癥小體的激活及下游細胞焦亡的發生，能夠改善ALI。

4.7 腫瘤 GSDMD在胃癌細胞系和模型中表達降低，進一步研究發現，GSDMD降低后通過激活細胞周期相關蛋白STAT3和PI3K/PKB通路的表達，加速S/G2相的轉變，促進腫瘤細胞生長。并且與正常裸鼠相比，GSDMD表達降低的細胞在植入胃癌細胞后腫瘤體積更大，說明GSDMD的表達水平與胃癌的發生有關[36]。

細胞凋亡是癌癥發生的主要原因之一，逃避細胞凋亡是化學和放射性療法的促成原因。激活非凋亡的程序性細胞死亡(PCD)可能是抗凋亡性癌癥的有效替代療法。食管鱗狀細胞癌(ESCC)患者有較高水平的PELP1表達，研究顯示，PELP1參與細胞凋亡和細胞自噬的調控。二甲雙胍在最近的研究中表明其有抗癌作用，它能通過靶向miR497/PELP1通路誘導ESCC發生GSDMD介導的細胞焦亡，減少細胞凋亡的發生[37]。

腫瘤的發生與多種因素有關，包括原癌基因和抗癌基因的活性，免疫微環境，氧化應激反應和慢性炎癥。組織或細胞長期暴露于炎癥環境會增加患癌的風險。一方面，腫瘤細胞焦亡意味著腫瘤細胞的生長受到抑制從而顯示出抗腫瘤活性，炎癥小體的產生能抑制某些腫瘤的發生。另一方面，在細胞焦亡過程中炎性因子的釋放會激活促細胞周期激酶，形成腫瘤生長微環境，促進腫瘤生長。綜上，GSDMD介導的細胞焦亡的發生在腫瘤中的存在還需要進一步的研究。

5 展望

隨著細胞焦亡基礎研究的不斷深入，人們對細胞焦亡的發生、發展有了更多的了解。而GSDMD作為一個新發現的蛋白，對其功能、結構的探究促進靶向藥物的開發，從而能夠治療多種與細胞焦亡相關的疾病。目前針對細胞焦亡的藥物還在探索階段，靶向細胞焦亡的研究不僅對相關方向新藥設計和開發有積極作用，還能進一步探索細胞焦亡與多種疾病之間更深層次的聯系。但是不僅僅是GSDMD，還有GSDM家族其他蛋白也參與細胞焦亡，對于它們與細胞焦亡之間的關系以及細胞焦亡與多種細胞死亡方式之間的轉化與平衡，還需要更深入的研究。