中性粒細胞胞外誘捕網及其參與的免疫炎癥性疾病研究進展

劉春曉，胡慶華

(中國藥科大學藥學院，江蘇 南京 211198)

中性粒細胞是人體固有免疫系統中含量最豐富的一類先天免疫效應細胞，具有廣泛的免疫活性。中性粒細胞能夠通過吞噬作用、氧化應激以及形成中性粒細胞胞外誘捕網(neutrophil extracellular traps，NETs)的方式參與機體免疫[1]。NETs是由中性粒細胞產生的一種以DNA為基本骨架表面附著有組蛋白、胞質蛋白、蛋白酶和其他顆粒蛋白的一種纖維網狀結構，中性粒細胞產生NETs并伴隨著細胞裂解死亡的過程被稱為NETosis。盡管如此，亦有報道顯示并非所有NETs的釋放都伴隨著細胞的裂解死亡，在革蘭陽性菌感染的早期，可以觀察到非裂解性的NETs 釋放，即NETs釋放但不發生細胞的裂解死亡。NETs能捕獲并幫助消除細菌、真菌、病毒或寄生蟲等病原體[2-5]。然而某些情況下，過度的炎癥反應反而會損害宿主并導致組織功能障礙[6-7]。

本文主要綜述了中性粒細胞NETs的形成調控機制、NETs在一些免疫炎癥性疾病中的病理作用，總結了干擾NETs形成的小分子化合物以及可能通過調節NETs產生起到治療疾病作用的藥物。

1 NETs的形成和調控

1.1 NETs的形成 NETs的形成與活性氧(reactive oxygen species，ROS)途徑密切相關，其中NADPH氧化酶與中性粒細胞彈性蛋白酶(NE)在NETs的形成過程中發揮著重要的作用。NADPH氧化酶產生的ROS激活髓過氧化物酶(MPO)觸發NE從嗜酸性顆粒活化轉運到細胞核，NE水解染色質上的組蛋白，使染色質去組裝成為游離的DNA[3,8]。然而NADPH氧化酶并不是NETs形成所必需的，有報道顯示，在免疫復合物誘導的NETs形成中，線粒體的ROS足以驅動NETs形成，不需要NADPH氧化酶的參與[2]。而在系統性紅斑狼瘡(SLE)中NADPH氧化酶及線粒體產生的ROS均參與了NETs的形成過程，NADPH氧化酶功能的缺失將導致對線粒體ROS依賴的增加[9]。MPO-NE途徑參與包括真菌和晶體在內的多種刺激物誘導的NETs形成過程[10-11]，MPO缺陷[12]及NE缺陷[13-14]已被證明可以在多種疾病模型中抑制NETs的形成，而NADPH氧化酶缺陷也被報道可以在肺部真菌感染期間抑制NETs的生成[15]。

肽酰基精氨酸脫亞氨酶(PAD4)是NETs形成過程中另一重要的功能蛋白，PAD4通過驅動組蛋白脫氨或瓜氨酸化參與染色質去組裝的過程[16-17]。在NETs形成的過程中，PAD4位于ROS信號傳導的下游，不同刺激物激活的PAD4對組蛋白瓜氨酸化的程度和特異性也有所不同[18-20]。目前，關于PAD4能否在NE缺陷型小鼠中性粒細胞中獨立誘導染色質的去組裝還沒有明確的報道，但NE的抑制劑可以在肺部真菌感染的過程中阻止染色質的去組裝而不干擾組蛋白的瓜氨酸化[21]。總之，這些蛋白酶的藥理學抑制作用會在各種情況下阻止染色質的去組裝，而它們同時也是藥理學中NETs檢測中的重要指征。

1.2 NETs的調控 在NETs形成的過程中，ROS上游的調控通路尚未完全明晰，已知被報道的有多種ROS的誘導受體(BOX1)和激酶，如MEK(MAPK/ERK激酶)、細胞外信號調節激酶(ERK)、IL-1相關激酶(IRAK)、PKC以及磷酸激酶3-激酶(PI3K)等[22-25]。其中PI3K的發現提示我們自噬可能也參與了NETs的調節，因為PI3K在自噬途徑中也發揮著關鍵性的作用。有研究發現，在缺乏自噬相關蛋白ATG7的中性粒細胞中NETs的生成被部分抑制[26]，而針對自噬通路關鍵蛋白mTOR的靶向抑制雷帕霉素同樣也對NETs有抑制作用[27]。ROS能夠誘導自噬的發生，而自噬的發生又維持了ROS的爆發并協助氧化應激，提示NETosis與自噬之間存在潛在的聯系[28-29]。

病原體的大小也是NETs形成調控過程中的一個重要因素。中性粒細胞對病原體大小的感知決定了NETs形成和吞噬作用之間對NE的競爭。這種機制使得中性粒細胞能夠針對大型病原體產生NETs，而針對小型病原體發生吞噬作用并抑制NETs[21]。當病原體體積較小時，病原體被吞噬體吞噬，該吞噬體與嗜酸性顆粒融合，從而阻止染色質去組裝。而當病原體過大而無法被吞噬體攝取時，NE可進入細胞核并驅動NETs。然而，也有研究報道了關于小細菌引起NETs的情況，牛分枝桿菌卡介苗通過形成聚集體的方式驅動NETs形成[30]，而淋病奈瑟氏球菌則通過延遲吞噬體與嗜酸性顆粒的融合誘導NETs[31]。總之病原體可以通過多種機制調節NETs形成，已知的影響因素包括體積大小和毒力因子的表達。

2 NETs與疾病

NETs在機體中有著殺死病原體和造成宿主損傷的雙重作用。一方面，當發生較大的病原體感染時(比如真菌菌絲)，NETs發揮著主要的抗菌作用[21,32]。在人群中，MPO缺乏癥的患者會出現反復的真菌感染癥狀引起慢性肉芽腫(CGD)，而對CGD患者給予藥物誘導ROS的產生促進NETs形成，可以恢復其中性粒細胞清除念珠菌分生孢子和菌絲的能力[33]。NETs在白色念珠菌性角膜炎中也發揮了重要的免疫作用，使用糖皮質激素進行治療會影響中性粒細胞的浸潤和NETs的形成從而加劇真菌性角膜炎[34]。在寄生蟲相關的疾病中，NETs通過捕獲和殺滅入侵的寄生蟲發揮免疫作用。研究顯示，NETs通過影響寄生性吸蟲幼蟲的遷移促進免疫系統對寄生性吸蟲的消滅[35]。而在鉤蟲感染中，雖然NETs也能夠在體外殺死鉤蟲幼蟲，但鉤蟲幼蟲能夠通過分泌脫氧核糖核苷酸酶逃脫中性粒細胞的免疫作用[36]。另外NETs也在抵御對中性粒細胞其他抗菌途徑有破壞作用的劇毒細菌中起著關鍵作用，NETs可以降低HIV病毒粒子的感染性，而DNase I處理的NETs則不具備這種功能[37]。

另一方面， NETs還參與了許多疾病的病理過程，在嚴重流感病毒感染期間，NETs的釋放會造成組織損傷和細菌過度生長，而通過抗體耗竭中性粒細胞或DNase Ⅰ 的干預可以降低小鼠的死亡率[38]，近期研究也顯示，在登革熱感染過程中，脾臟中NETs的沉積與血管通透性和病毒的致死性密切相關[39]。NETs還參與了血小板活化及血栓形成過程，因此與卒中、動脈粥樣硬化和抗磷脂綜合征等疾病的發病密切相關[40-42]。隨著對NETs研究的深入，與NETs相關的病理機制也不斷地被發現，尤其是在各種免疫炎癥性疾病中由于NETs過度產生導致的組織損傷。本章重點介紹與NETs相關的涉及的各種免疫炎癥性疾病的病理學過程。

2.1 NETs與感染性炎性疾病 敗血癥是細菌等病原微生物在循環系統中大量繁殖而引起的一種全身感染性疾病，具有很高的致死率。當敗血癥發生時，血小板Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)響應病原體與中性粒細胞結合并介導其放NETs并隨循環系統轉移到其他組織和器官[43]。NETs在敗血癥中主要起有害作用，NETs與耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌引起的敗血癥對肝的損害有關，這種損害可以被NE或PAD4敲除所抑制[44]。在敗血癥中，循環系統中的組蛋白能夠破壞細胞膜完整性，在實驗中用抗體中和組蛋白后，NETs引起的組織損傷明顯減弱，表明NETs結合的組蛋白在NETs介導的細胞毒性作用中起著核心作用[45]，NETs還與敗血癥引起的彌漫性血管內凝血密切相關[46]。

2.2 NETs與肺部炎癥性疾病 NETs與肺部炎癥性疾病關系密切，肺部在病理狀態下可以募集大量的中性粒細胞，而中性粒細胞產生的NETs也參與了多種肺部疾病的病理過程[47]。急性呼吸窘迫綜合征(ARDS)是一種致死性疾病，其病理特征主要表現為由中性粒細胞響應病原體相互作用而引起的廣泛的炎癥性肺損傷，肺炎和敗血癥是該疾病的主要病因。在耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌和銅綠假單球菌引起的急性肺損傷小鼠模型中，使用DNase Ⅰ 干預或部分敲減PAD4(PAD4+/-)可部分降低NETs并提高小鼠生存率，然而完全敲除PAD4-/-雖然可以完全抑制NETs減輕肺損傷但也會加劇細菌感染的程度而加重炎癥[48]。

囊性肺纖維化是以中性粒細胞持續流入受炎關節以及NETs持續釋放為病理特征的慢性呼吸道疾病。在囊性肺纖維化的發病過程中，中性粒細胞和NETs通多堵塞氣道而導致肺功能降低。肺部的慢性感染是由富含DNA和中性粒細胞蛋白的痰液引起的，而痰液中的DNA和中性粒細胞蛋白則被認為是由NETs釋放[47]。在囊性肺纖維化患者中確實發現有持續的NETs產生，且NETs的產生量與炎癥和疾病的嚴重程度成正相關。銅綠假單球菌是引起囊性肺纖維化的病原體，但現有的研究已證明臨床分離的銅綠假單球菌菌株對NETs介導的殺生具有抗性，而且NETs的存在會促進肺纖維化區域的產生，還會刺激巨噬細胞從而導致持續的炎癥反應。DNase Ⅰ 可以溶解囊性肺纖維化患者的痰液并改善囊性肺纖維化小鼠的肺功能[49]。

在2019年新型冠狀病毒疾病(COVID-19)中，NETs與炎癥的傳播、微血管血栓形成和后期的急性呼吸窘迫綜合征相關。在COVID-19患者的血清中，可以檢測到胞外DNA、MPO和Cit-H3等NETs的特征性標記表達的升高，且與輕癥患者相比，發生呼吸窘迫的重癥患者的胞外DNA和MPO的水平更高，更重要的是COVID-19患者的血清可以在體外誘導NETs的生成[50]。另外NETs的形成還與ARDS、血栓形成、動脈粥樣硬化等多種疾病的發病相關，這可能與COVID-19重癥患者中出現的呼吸窘迫或血栓過多等癥狀相關，因此靶向NETs可能是治療呼吸窘迫的重癥患者以及降低死亡率的潛在靶點[51]。

2.3 NETs與晶體誘導的炎癥性疾病 痛風是一種急性炎性關節炎疾病，由針狀的尿酸鈉晶體(MSU)在關節部位累積引起，晶體沉積在關節或腎臟進而引發炎癥反應。中性粒細胞在痛風急性炎癥發作的進展和消退中的作用尚未明確。在痛風的病理過程中，關節部位的免疫細胞被MSU激活后募集中性粒細胞至受炎關節部位。被募集的中性粒細胞響應MSU晶體，從而發生NETosis并釋放炎性因子。關于NETs在痛風中的作用目前還不清楚，有研究認為NETs大量聚集產生的aggNETs在急性痛風性關節炎的炎癥消退階段發揮著關鍵性的作用[52]。但也有報道顯示中性粒細胞耗竭并不影響急性痛風性關節炎的消退，相反在沒有中性粒細胞的情況下，急性炎癥期的炎癥被明顯抑制[53]，提示中性粒細胞釋放的NETs在急性痛風性關節炎的炎癥發作階段是有害的，但其在輔助炎癥消退方面的作用還需要等待進一步確證。

青少年皮肌炎(JDM)是罕見的血管病變，一般在兒童時期患病并伴有成年后心血管早衰的嚴重不良后果，在JDM的發病過程中會發生鈣化現象，在軟組織中形成鈣晶體，值得注意的是，鈣晶體多出現在發生皮膚炎癥的兒童中，表明鈣晶體與炎癥之間存在緊密關聯。最新的研究顯示，從JDM患者體內分離的鈣晶體能夠在體外誘導NETs的形成，且與健康及未發生鈣化的JDM患兒相比，發生了鈣化的JDM患兒的組織及外周血中NETs水平明顯升高，更重要的是靶向PI3K和NADPH氧化酶可以通過抑制NETs減少組織鈣化的頻率并預防動脈粥樣硬化等并發癥的發生[54]。

2.4 NETs與自身免疫性疾病 中性粒細胞NETs在自身免疫性疾病中也起著關鍵性作用。自身免疫性疾病是由于免疫系統對自身抗原不耐受而引起的炎性疾病。NETs通過將細胞內源性成分暴露于免疫系統參與自身免疫性疾病，且在炎癥的起始階段發揮著重要的作用，甚至可能導致自身抗體的產生。在系統性紅斑狼瘡(SLE)和類風濕性關節炎(RA)患者的血清和滑液中NETs的水平都有明顯的升高[55-56]。因此，SLE患者的血清中有高濃度的抗核糖核蛋白和抗DNA抗體，而RA患者血清中則含有抗瓜氨酸化蛋白的抗體,且DNase Ⅰ缺陷型的小鼠會出現狼瘡樣癥狀。但NETs在SLE中的作用非常復雜，有研究顯示，阻斷線粒體的ROS產生可以在狼瘡小鼠模型中阻斷NETs并降低疾病的嚴重程度，但NADPH氧化酶缺失卻會加重疾病。另一項研究解釋了這一現象，系統性紅斑狼瘡中的NETs是由NADPH氧化酶非依賴性的途徑介導的，但目前尚不清楚NETs是否可以作為SLE的治療靶點[57]。

原發性抗磷脂綜合征(APS)是一種自身免疫性疾病，主要表現為抗磷脂抗體(aPLs)的持續升高，使得個體易于發生動、靜脈血栓或妊娠并發癥。NETs與血小板激活和血栓形成之間的關系已被廣泛報道，其在APS血栓形成中的作用也已得到確證，aPLs能夠在體外誘導中性粒細胞NETs的釋放，而從APS患者外周血中分離得到的中性粒細胞也更容易發生NETosis[58]。使用雙嘧達莫治療也能通過抑制NETs的形成而抑制aPLs誘導的小鼠血栓[59]。

2.5 NETs與其他炎癥性疾病 急性胰腺炎是由于胰酶在胰腺內被異常激活后引起胰腺組織自身消化、水腫、出血甚至壞死的急性炎癥反應。重癥的急性胰腺炎會導致胰腺出血、繼發感染、肺部炎癥和休克，致死率高。有報道顯示，L-精氨酸和膽堿缺陷型乙硫氨酸補充(CDE)飲食模型中，可以觀察到胰腺組織中有NETs的形成，而在PAD4-/-小鼠中小鼠胰腺炎的嚴重程度有所降低，且小鼠生存率有所提高[60]。而向腺泡中注射NETs和組蛋白可誘導胰蛋白酶的形成，表明在急性胰腺炎的發病過程中，NETs不僅能夠增加急性胰腺炎的炎癥程度還可能直接參與了AP的病理生理過程，但其誘導胰蛋白酶形成的機制尚不清楚[61]。

3 NETs的治療

3.1 DNase Ⅰ DNase Ⅰ 是最常用的NETs的抑制劑，是NETs的內源性降解酶，通過降解NETs的DNA骨架降解NETs，已被證明可以改善多種由NETs引起的病理反應。DNase Ⅰ的優點是該藥物在臨床上正在使用，DNase Ⅰ在臨床上主要用于支氣管擴張、肺膿腫、囊性肺纖維化等濃痰引起的炎癥性疾病[62]，且沒有表現出明顯的毒副作用。然而DNase Ⅰ雖然能在狼瘡小鼠模型中降解NETs，降低疾病的嚴重程度，但臨床上將重組DNase Ⅰ用于SLE患者的治療，患者血清標志物及其疾病情況卻無明顯的變化。此外，DNase Ⅰ只能分解DNA骨架而不能降解隨NETs釋放的組蛋白、彈性蛋白等顆粒蛋白，但這些蛋白卻是NETs中重要的毒性因子[38]。

3.2 關鍵分子的抑制劑 研究過程中經常通過運用一些分子的抑制劑或敲基因動物來達到抑制NETs形成的目的，這些分子都可以作為NETs的治療靶標。NE的抑制劑是目前研究最充分的抑制劑，目前NE的抑制劑塞來司他已在日本和韓國被批準用于ARDS的治療，但在臨床試驗中它并沒有增加ARDS的存活率，而最新的研究表明，用納米顆粒系統遞送塞來司他可以提高其在體內的利用率，從而提高塞來司他的成藥性[63]。ROS的抑制劑(N-乙酰半胱氨酸)可以改善SLE患者的預后，而在狼瘡小鼠模型中線粒體ROS的特異性清除劑可以降低疾病的嚴重程度并抑制NETs的產生[64]。但是，通過靶向NADPH氧化酶抑制劑干預RA和SLE小鼠模型中NETs的生成，則會導致剛嚴重的病理情況。NADPH氧化酶缺陷的患者也有更高的患自身免疫性疾病的風險。PAD4也是NETs形成過程中的關鍵分子，它可以在不影響氧化爆發的情況下抑制NETs生成，研究表明PAD抑制劑(例如：Cl-am或BB-Cl-am)能夠在小鼠狼瘡模型、小鼠炎性關節炎模型和小鼠糖尿病模型中抑制NETs生成并延遲疾病[65]。另外，MPO的抑制劑PF1355可以在小鼠的血管炎模型中抑制NETs的產生[66]。然而這些酶往往是維持正常生理活動所必需的，如果想在臨床上運用其抑制劑來抑制NETs治療相關疾病，必然要求藥物有極高的選擇性，否則會引起嚴重的副作用。而NETs本身也是機體的一種重要的抗菌防御機制，在抵御真菌等大型病原體上發揮著重要的作用，以NETs為靶點進行疾病治療本身就存在導致嚴重的感染或慢性肉芽腫樣癥狀的風險。

3.3 影響NETs生成的已上市藥物 一些已上市的藥物已被證明可能是通過抑制NETs來發揮其作用的，雷帕霉素是大環內酯類的mTOR特異性抑制劑，在臨床上主要通過抑制T淋巴細胞的作用來達到免疫抑制的目的，最新研究發現它還可以通過抑制mTOR減少缺氧誘導因子1α(HIF-1α)的表達進而抑制中性粒細胞NETs的生成，而這也可能是其實現免疫抑制的途徑之一[27]。塞來司他是一種小分子的NE抑制劑，能夠在體外抑制NETs的形成，在體內用塞來司他也能有效抑制LPS引起的小鼠肺損傷[63]。雙嘧達莫是一種用于擴張冠脈血管、抗血栓形成的藥物，可以通過增加胞外腺苷濃度和干擾胞內cAMP的分解來增強腺苷介導的信號轉導通路。而胞內cAMP含量的升高能夠通過抑制NADPH氧化酶的活性減少ROS，從而抑制中性粒細胞NETs的生成。最新的研究發現，雙嘧達莫可以通過升高胞內cAMP的含量，抑制中性粒細胞NETs的產生，從而達到抗血栓的作用[59]，這些發現為以NETs為靶點開發新的藥物提供了新的希望。

4 小結與展望

NETs作為中性粒細胞重要的免疫手段之一，在許多真菌等大型病原體介導感染性疾病中發揮著重要的抗菌作用，但是當它的抑制機制失調或被過度激活時，它也可能會介導疾病的病理過程。NETs的病理作用主要表現在炎癥性疾病中導致宿主損傷或在自身免疫性疾病中導致適應性耐受性的下降。現在，以NETs為靶點的藥物研究還比較少，主要是因為考慮到NETs本身潛在的有益的抗菌功能，如果對其進行全身性的抑制，可能會出現嚴重感染或慢性肉芽腫樣癥狀等副作用，因此在以NETs為靶點進行藥物研究時一定要高度重視對其靶向性和特異性的考察。但關于雷帕霉素和雙嘧達莫的報道為以NETs為靶點進行藥物研究和臨床治療提供了可能。通過進一步的研究了解NETs的調控、功能和病理作用，最終實現在不干擾其免疫作用的前提下抑制其損傷屬性并用于指導臨床治療和藥物研究。