質譜快速鑒定兩例AIDS合并真菌性血流感染病例分析

丁 寧，王玉月

(1.常州市婦幼保健院檢驗科，江蘇常州 213000；2.常州市第一人民醫院檢驗科，江蘇常州 213003)

獲得性免疫缺陷綜合征(AIDS)是由人免疫缺陷病毒(HIV)引起的嚴重危害人類健康的傳染病，以損傷免疫系統為主要特征，患者極易獲得機會性感染，而新型隱球菌、馬爾尼菲藍狀菌等深部真菌的機會性感染是AIDS患者死亡的主要原因之一[1]。新型隱球菌最常引起的感染為隱球菌性腦膜炎，其發病隱匿、病死率高?；颊咧饕憩F為難以忍受的頭痛，伴發熱、惡心、嘔吐，腦膜刺激征陽性等腦膜炎的癥狀與體征[2]。隱球菌性腦膜炎在健康人群中很少發生，但在AIDS患者中發病率較高。馬爾尼菲藍狀菌是一種條件性高致病性真菌，同時也是青霉菌屬中唯一的雙向真菌，主要侵襲免疫低下的人群，尤其是AIDS患者。其臨床表現復雜多樣且缺乏特異性，有文獻報道，85%的馬爾尼菲藍狀菌感染發生于AIDS患者，已成為AIDS臨床診斷的指征性癥狀之一[3]。

基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF MS)是一種新型軟電離生物質譜技術，通過檢測每種病原菌特征性的蛋白指紋圖譜，并與數據庫中的圖譜庫進行比對即可鑒定出待測病原菌。將MALDI-TOF MS聯合分離膠促凝管直接檢測血培養陽性瓶中的病原菌，可以極大地縮短檢測時間[4]，為臨床提供可靠的診斷依據。

本文通過回顧分析2例明確診斷的合并真菌感染的AIDS病例，探討質譜鑒定對AIDS患者合并真菌感染診斷的臨床價值。

1 病例資料

1.1一般資料 2018年9月常州市第一人民醫院呼吸科及血液科收治的2例合并真菌感染的HIV患者。病例1，男，56歲，因“咳嗽伴乏力、納差半月余”入院?；颊呷朐呵?月無誘因出現陣發性咳嗽，1周前至當地醫院就診查胸片提示支氣管炎，予“順爾寧、蘇黃止咳膠囊”，癥狀無改善，后出現乏力、納差進行性加重。2 d前進食后嘔吐少許胃內容物，于本院門診就診并行相關檢查?；颊咦允鲎云鸩磉M食逐步減少，體質量減輕約5 kg。患者神志清，精神萎，慢性病面容。胸部CT示右肺下葉多發空腔性病變，多發肺大皰伴感染，右肺下葉外基底段結節，右肺上葉后段少許炎癥，左肺多發纖維灶。病程中患者出現一次發作性雙眼上翻，持續數秒后好轉；嗜睡，呼之睜眼，頸部稍有抵抗。診斷為：肺部陰影：真菌感染可能；腦炎(真菌性可能)。病例2，女，39歲，因“發現鎖骨上淋巴結腫大2周余”入院?；颊?周前無明顯誘因發現左側鎖骨上淋巴結酸痛腫大，伴有咳嗽、咳痰、發熱，并感全身乏力、頭暈不適?；颊卟〕讨杏袝炟?次，約15 s后意識恢復。患者體溫39 ℃，神志清，精神萎。正電子發射計算機斷層顯像示多發淋巴結氟代脫氧葡萄糖代謝增高，考慮淋巴瘤浸潤；左上肺磨玻璃影結節氟代脫氧葡萄糖代謝增高；兩肺局部輕度炎癥，右中肺微小結節。診斷為：淋巴結腫大待查、肺部感染。

1.2MALDI-TOF MS鑒定 抽取5 mL陽性血培養液注入分離膠促凝管，需氧瓶抽取的血培養液以4 000 r/min離心10 min，厭氧瓶中抽取的培養液經3 500 r/min離心7 min，分離待測病原菌。棄去分離膠促凝管內上層液體，緩慢注入1 mL無菌蒸餾水將待測菌沉淀混懸(不破壞促凝膠)，將混懸液轉移至無菌1.5 mL小型離心管中，經13 000 r/min離心1 min。棄去上清液后重復洗滌一次，最后將離心后管底的細菌混懸于1 mL無菌蒸餾水中待檢。取300 μL待測菌重懸液與900 μL無水乙醇混合，經13 000 r/min離心1 min后棄去上清液，再經多次離心以完全去除殘留的無水乙醇，放置于空氣中自然干燥。加入70%甲酸30 μL使待測菌充分混勻，再加入乙腈30 μL旋渦混勻，經13 000 r/min離心2 min，取上清液用于MALDI-TOF MS鑒定。取制備好的上清液1 μL涂布于96孔金屬靶板，室溫干燥后在金屬靶板表面加入基質液α-氰-4-羥基肉桂酸1 μL，再次室溫干燥后進行檢測。參數設置：線性，正離子，蛋白峰譜m/z范圍2～20 ×103，激光解析每孔100次。應用Biotyper 3.0統進行數據庫比對，得出鑒定結果。

1.3API 20 C板條鑒定 抽取血培養瓶中的培養液進行純培養，將分離到的菌落用無菌生理鹽水配制成2個麥氏單位待測菌懸液，取100 μL懸液至API C Medium培養基中，混勻后加入鑒定板條，28 ℃培養72 h后進行結果判讀。

1.4真菌小培養 將馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基切割成小塊置于載玻片上，用接種環挑取純培養的絲狀真菌接種于培養基的四角，蓋上蓋玻片，28 ℃培養2～3 d后用乳酸棉蘭酚染色，于高倍鏡下觀察真菌形態。

2 結 果

2.1質譜鑒定結果 2例患者均在入院后送檢血培養，在血培養報陽后直接用質譜儀進行檢測。病例1鑒定結果為新型隱球菌，質譜評分為2.142。病例2鑒定結果為青霉菌屬某些種，質譜評分為1.474。見圖1。

2.2傳統鑒定結果 病例1：患者血培養雙側需氧瓶分別于67、70 h報警陽性，涂片革蘭染色鏡檢找到正圓形的芽生孢子。將標本接種在血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板及沙保弱培養基上，35 ℃ 48 h培養均長出白色光滑酵母樣菌落。經API 20 C板條鑒定為新型隱球菌。見圖2。病例2：患者血培養雙側需氧瓶分別于77、89 h 報警陽性，涂片革蘭染色找到豐富的菌絲及少量真菌孢子，孢子兩頭鈍圓、中間有隔的臘腸形。將標本接種在血瓊脂平板、巧克力瓊脂平板及沙保弱培養基上，分別于28 ℃和35 ℃孵育48 h，血平板上可見灰白色臘樣、膜狀平坦菌落，菌落中央可見臍狀凹陷； 35 ℃培養的沙保弱斜面上可見白色酵母樣菌落，不產生紅色色素。28 ℃培養的沙保弱斜面上可見淡紅色絨毛狀菌落，整個培養基被染成玫瑰紅色。真菌小培養后可見分枝分隔菌絲，分生孢子梗光滑，呈帚狀枝分散，多為對稱雙輪生；?；嫌?～6個瓶梗，頂端變窄。通過培養的雙相性以及帚狀枝形態可鑒定為馬爾尼菲藍狀菌。見圖2、3。

注：A表示新型隱球菌質譜圖；B表示青霉菌某屬質譜圖。

圖1質譜鑒定兩例血培養陽性結果

圖2 隱球菌血培養直接涂片(10×100)

2.3最終診斷結果 病例1患者經神經內科會診后考慮腦血管意外及HIV腦病，經市傳染病醫院會診后考慮AIDS，中樞神經系統感染，隱球菌腦炎。予甘露醇脫水，伏立康唑靜滴抗真菌及糾正電解質紊亂等治療，并轉至市傳染病醫院進行進一步治療，目前患者情況穩定，恢復良好。病例2患者淋巴結活檢示鎖骨上淋巴組織增生，中性粒細胞灶性浸潤，小膿腫形成伴多量組織細胞反應，傾向感染性變化。請市傳染病醫院會診考慮AIDS，并轉至市傳染病醫院進行進一步治療。

注：A表示血培養直接涂片革蘭染色鏡檢結果(10×100)；B表示35 ℃孵育48 h菌落形態；C表示28 ℃孵育48 h菌落形態；D表示真菌小培養乳酸棉蘭酚染色鏡檢結果(10×40)。

圖3病例2血培養陽性涂片結果及純培養菌落特點與鏡下結果

3 討 論

真菌性血流感染是AIDS患者較為常見的機會性感染，謝朝云等[5]報道艾滋病合并真菌感染發病率為36.61%。新型隱球菌和馬爾尼菲藍狀菌是AIDS常見的機會致病真菌，有文獻報道AIDS患者合并隱球菌腦膜炎的一年歸因死亡率為24.2%[6]，合并感染馬爾尼菲藍狀菌的病死率可達18%～26%[7]，因此及時的病原學診斷是關鍵。隱球菌性腦膜炎患者多表現為發熱、頭痛及嘔吐等中樞神經癥狀，病例1中的患者在病程中出現嗜睡、頸部稍有抵抗等隱球菌性腦膜炎相關癥狀，與最終鑒定結果完全相符合。馬爾尼菲藍狀菌感染后，臨床表現為發熱、肝脾腫大、淋巴結腫大、呼吸和消化系統異常等癥狀，病例2中的患者經淋巴結活檢提示淋巴結膿腫，排除了淋巴瘤的可能，其癥狀與馬爾尼菲藍狀菌感染相符。

回顧2例患者的診斷過程，病例1中的患者懷疑感染，病例2中的患者病情較為復雜，高熱且主訴淋巴結腫大，對于這兩類臨床上暫時無法確診的患者，首先應采集血液、腦脊液、骨髓等標本進行涂片與培養，盡可能地查找病原學依據[8]，及時的病原學診斷對成功治療深部真菌感染起到極大的作用[8]。傳統真菌鑒定的方法雖然較為準確，但其耗時長，對檢驗者經驗要求高，極易造成誤診及漏診。質譜儀的使用極大地縮短了檢測時間，將分離膠促凝管聯合質譜儀可以直接檢測血培養陽性的病原菌，縮短了轉種培養鑒定的時間。隱球菌的傳統鑒定主要依賴API板條，需要72 h才能判讀結果，而墨汁染色雖較為便捷，但由于隱球菌莢膜厚薄不定，結果觀察受檢驗者經驗影響較大[9]。傳統方法鑒定馬爾尼菲藍狀菌需要4～10 d[7]，采用質譜快速鑒定的方法當天即可給出該真菌屬的初步鑒定結果，且檢測結果與傳統真菌培養的結果相符合，極大地減少了花費在真菌鑒定上的時間成本[10-11]。雖然對青霉菌只能鑒定到屬的水平，仍需結合經典的真菌培養及形態學觀察才能鑒定到種的水平，但這無疑可以為臨床診療爭取到更多的時間。此外，相較于傳統真菌鑒定方法，使用質譜儀直接鑒定血培養陽性瓶中的真菌操作更加簡單，且易于制定標準化操作流程，從而可以減少人為因素造成的鑒定誤差。

綜上所述，AIDS患者易合并條件致病性真菌的感染，真菌感染的診斷依賴病原學鑒定。傳統形態學鑒定對于真菌感染的診斷有重要意義，但其耗時較長，而質譜技術的出現簡化了操作流程，縮短了鑒定時間，為臨床真菌感染的治療贏得了時間。提高對不明原因發熱或感染患者的血培養送檢率，盡早查找病原菌并及時對癥治療，結合新興的質譜技術縮短病原菌檢測時間，為臨床診斷提供更加及時可靠的依據。