基因魔剪CRISPR/Cas：核酸精準檢測的新寵和利器*

馮春鳳，王云霞，蒲曉允，熊 瑜，劉 飛 綜述，張立群△ 審校

(1.陸軍軍醫大學第二附屬醫院檢驗科，重慶 400037；2.陸軍軍醫大學第一附屬醫院檢驗科，重慶 400038)

規則成簇間隔短回文重復序列及其相關蛋白(CRISPR/Cas)系統是細菌和古細菌在進化過程中形成的一種適應性免疫應答系統，其機理是保護自身免受入侵病毒和質粒的影響[1]。CRISPR由多個高度保守的重復序列與噬菌體或質粒DNA存在同源性的間隔序列串聯而成[2]。CRISPR區域中，位于第一個重復序列上游的是前導序列，負責CRISPR序列轉錄生成CRISPR RNA(crRNA)。CRISPR位點附近為CRISPR相關蛋白基因Cas，Cas基因編碼的蛋白具有核酸內切酶活性，可切割外源性DNA，是CRISPR/Cas系統執行防御功能的重要組成部分。當病毒首次入侵時，細菌將病毒小片段DNA整合到自身CRISPR基因的間隔序列中。病毒再次入侵時，CRISPR轉錄生成crRNA。在crRNA的引導下，具有核酸內切酶活性的Cas蛋白對含原型間隔序列毗鄰基(PAM)的靶標序列進行特異性識別和切割[3]。研究表明，Cas蛋白不僅可用于基因編輯，在核酸檢測方面也具有非常重要的應用價值[1]。

現有的核酸檢測方法大多數操作步驟復雜且依賴于昂貴的儀器設備。理想的核酸檢測技術應具備便攜、快速、低成本、靈敏度高及特異性強的特點。近期，科學家們將被譽為“基因魔剪”的CRISPR/Cas系統與其他技術尤其是核酸擴增技術相聯合，開發了一系列基于CRISPR/Cas系統的核酸檢測技術。這些技術可直接檢測經過簡單處理的臨床樣本，樣本用量極少且無需貴重儀器設備，顯示出極高的靈敏度和特異度，操作極其簡便，已具有發展成為理想的核酸快速精準檢測技術的潛力。

1 CRISPR/Cas9在核酸檢測中的應用

1.1CRISPR/Cas9 Cas9是Ⅱ型CRISPR/Cas系統的標志性蛋白，在反式激活crRNA(tracrRNA)與成熟crRNA堿基互補配對形成的雙鏈RNA(tracrRNA/crRNA)的引導下，特異切割靶雙鏈DNA(dsDNA)。由于tracrRNA/crRNA的設計較復雜，KONERMANN等[4]隨后將tracrRNA和crRNA整合到一條RNA鏈中，并稱之為單向導RNA(sgRNA)，極大地簡化了CRISPR/Cas9系統的操作步驟。Cas9介導的位點特異性DNA切割依賴于sgRNA對靶序列dsDNA上的PAM序列的特異識別，不同來源的Cas9識別的PAM序列存在差異。其中，應用最廣泛的化膿性鏈球菌Cas9核酸內切酶切割靶標時依賴于含5′-NGG-3′的PAM序列。當存在與靶標單鏈DNA(ssDNA)或單鏈RNA(ssRNA)雜交并起到PAM作用的寡核苷酸時，sgRNA/Cas9也可以裂解ssDNA和ssRNA。

1.2基于Cas9核酸內切酶活性的核酸檢測技術 針對不同的檢測靶標可設計與之互補配對的sgRNA，從而使Cas9/sgRNA復合物可特異性切割各種不同靶序列。2016年，PARDEE等[5]最先將CRISPR/Cas技術用于核酸檢測。他們將CRISPR/Cas技術與合成技術相結合，開發了一種快速、低成本檢測寨卡病毒及區分其亞型的紙質傳感器。寨卡病毒RNA經核酸依賴性擴增及逆轉錄產生的dsDNA作為sgRNA/Cas9復合物的底物，另外設計一個分子開關作為檢測RNA的傳感器，并將這種傳感器轉移到試紙條上冷凍干燥。隨后將核酸依賴性擴增檢測技術的反應產物滴加到試紙條上，通過觀察試紙條的顏色是否發生改變，判斷檢測結果。應用該技術可檢測不同的寨卡病毒亞種，并區分出感染后臨床癥狀相似的登革熱病毒。由于病原體存在進化漂移，因此分子診斷技術必須具備檢測基因突變的能力。該研究證實，具有高達4-nt(11%)錯配的變異菌株也能夠完全激活分子傳感器，表明該技術具有耐受自然界中預期遺傳變異的能力。HUANG等[6]將CRISPR/Cas9技術引入等溫指數擴增反應，開發了基于CRISPR/Cas9技術的指數擴增反應。他們將CRISPR/Cas9切割ssDNA產生的短片段作為等溫指數擴增反應的引物，使該技術適用于長鏈DNA或RNA的檢測，擴展了等溫指數擴增反應的檢測范圍，避免了外來引物的非特異性擴增。該方法具有較強特異性和檢測速度，檢測限可達0.82阿摩爾，適用于DNA、RNA和甲基化DNA等多種核酸的檢測，在生物分析和疾病診斷中具有巨大的應用潛力。

1.3基于dCas9特異結合靶序列的核酸檢測技術 dCas9是經化學修飾的Cas9，雖然其失去核酸內切酶活性，但仍然具有特異結合靶DNA的能力。ZHANG等[7]利用成對CRISPR/dCas9開發了一種PC核酸報告系統，并與聚合酶鏈式反應(PCR)聯合，用于檢測結核分枝桿菌。他們將熒光素酶的N端和C端(NFluc和CFluc)分別標記一對dCas9，當sgRNA/NFluc-dCas9、sgRNA/CFluc-dCas9與同一靶標結合且兩結合位點間距在(21±2)bp之間時，熒光素被氧化，發出熒光信號，從而檢測出病原體。隨后，QIU等[8]也開發了另一與之類似的核酸檢測技術，即RCA-CRISPR-split-HRP(RCH)系統。microRNA以啞鈴型探針為模板，經滾環擴增以后，形成大量莖環狀靶標。兩個dCas9分別被辣根過氧化物酶(HRP)片段(sHRP-C和sHRP-N)標記(sHR-C-dCas9和sHRP-N-dCas9)，然后與莖環狀靶標特異性結合，導致裂解HRP重建，底物四甲基聯苯胺從淺黃色變為藍色，從而實現microRNA的檢測。YANG等[9]，利用dCas9與靶標dsDNA特異性結合而不切割的特點，將其引入固態納米孔傳感技術。當sgRNA/dCas9復合物與靶標結合并穿過固態納米孔時，大大減少了離子的通過，從而產生明顯的電流阻斷信號。HAJIAN等[10]將sgRNA/dCas9與場效應晶體管相結合，開發了一種無需標記的CRISPR芯片技術。他們將dCas9固定在場效應晶體管表面，并與sgRNA形成復合物，從而特異地結合靶標并產生相應的電化學信號，該芯片在不擴增靶標的情況下即可達1.7 fM的靈敏度，并且在15 min內就可讀取檢測結果。

2 CRISPR/Cas12a在核酸檢測中的應用

Cas12a(又名Cpf1)屬于V型CRISPR/Cas系統，在crRNA的引導下特異識別裂解富含T核苷酸PAM序列的dsDNA或ssDNA[11-12]。2018年，CHEN等[13]發現毛螺旋菌科細菌(Lb)ND2006 Cas12a(LbCas12a)在crRNA的引導下，特異切割靶ssDNA或dsDNA后，也可非特異性誘導其附近非靶ssDNA的斷裂，具有與Cas13a相同的“附屬切割”活性。隨后他們將重組酶聚合酶擴增反應(RPA)與LbCas12a偶聯，開發了DNA內切核酸酶靶向CRISPR反式報告基因(DETECTR)核酸檢測技術。應用該技術成功檢測出了人乳頭瘤病毒16型和18型。DETECTR可在1 h內檢測出靶標并且靈敏度可達阿摩爾級，其檢測結果與PCR檢測結果具有良好的一致性。LI等[14]將crRNA/Cas12a與PCR相結合，開發出靈敏度、高特異性強的HOLMES核酸檢測系統，但該檢測系統需經過兩步反應。為了避免交叉污染，簡化操作步驟，后來他們開發出一步式反應。LI等[15]選取一種耐熱的Cas12b蛋白與環介導等溫擴增(LAMP)技術相結合，從而實現一步式反應，他們將該技術命名為第2版HOLMES(HOLMES V2)。WANG等[16]將RPA擴增試劑和Cas12a酶放在物理上相互分開的同一試管中，在RPA反應15 min后，Cas12a才添加到反應系統中，從而實現一步法檢測。

上述基于CRISPR/Cas12a的核酸檢測技術均結合了各種核酸擴增技術。最近，研究者不斷嘗試將該技術與各種傳感器相結合，試圖開發靈敏度高、特異性強的生物傳感技術。 SHAO等[17]將傳統的兩端分別標記熒光基團和猝滅基團的ssDNA熒光報道分子用磁珠-ssDNA-鉑納米(PtNP)復合物取代。當crRNA/Cas12a結合并切割靶標時，ssDNA也被非特異性地裂解，從而釋放出PtNP。隨后將該反應產物滴加到芯片上，通過PtNP催化過氧化氫產生的氧氣量來計算靶標的水平。DAI等[18]將crRNA/Cas12a引入電化學傳感器，該技術對HPV-16及細小病毒B19的檢測靈敏度達皮摩爾級。此外，他們通過設計針對轉化生長因子β1的適配體，從而實現了基于電化學和CRISPR/Cas技術的轉化生長因子β1的檢測。該技術的成功開發表明CRISPR/Cas技術不僅在檢測核酸方面具有重要的應用價值，而且在蛋白檢測方面也具有應用潛力。

3 CRISPR/Cas13a在核酸檢測中的應用

Cas13a(以前稱為C2c2)屬于Ⅵ型CRISPR系統，對靶標的識別依賴于由A、U或C堿基組成的PFS序列(相當于PAM序列)[19]。在crRNA的引導下，Cas13a特異性切割靶標ssRNA后，表現出核糖核酸酶活性，可將靶標附近的非特異性ssRNA進行切割[20]。GOOTENBERG等[21-22]將高度特異性的crRNA/Cas13a與RPA等溫擴增技術相結合，開發了一種特異性強、靈敏度高的酶報告解鎖(SHERLOCK)核酸檢測系統。該技術具有阿摩爾級的靈敏度和識別單個核苷酸錯配的特異性，當與T7 RNA聚合酶轉錄偶聯時，擴增的DNA可轉錄為RNA。因此，SHERLOCK在DNA和RNA的快速檢測方面均具有重要的應用價值。為了簡化操作、降低成本，隨后他們又開發了基于試紙條的SHERLOCK核酸檢測技術。通過16個患者樣品的SHERLOCK和寨卡病毒逆轉錄PCR的檢測結果比較發現，兩種檢測方法的靈敏度、特異度、一致性均達100%[23]。此外，該技術已成功用于鑒定細菌病原體、耐藥基因篩查以及無細胞腫瘤DNA突變等的檢測。

SHERLOCK系統雖可快速、靈敏地檢測核酸分子，但仍然存在一些局限，例如缺乏定量，依賴熒光設備讀取檢測結果，一次只能檢測一種核酸等。為了突破這些局限性，他們隨后將SHERLOCK系統進行了改裝，開發了更具有實用性的第2版SHERLOCK(SHERLOCK V2)核酸檢測技術。GOOTENBERG等[22]發現，來自不同細菌的Cas13在附屬切割時，對報告ssRNA中堿基的切割位點不同。他們在原版SHERLOCK中同時引入LwaCas13a，PsmCas13b，CcaCas13b和AsCas12a 4種核酸內切酶，設計針對4種不同靶標的crRNA并與相應的Cas蛋白組裝，用發出不同顏色的熒光分子分別標記4種特異合成的報告ssDNA或ssRNA。當檢測到靶標時，相應報告分子裂解，釋放對應顏色的熒光信號，從而實現在同一反應中檢測出4種不同的靶標。隨后他們又發現，在較低的引物水平下，反應不會達到飽和。因此，可通過控制引物的水平而實現核酸定量檢測，且檢測物水平可低至阿摩爾級。為了擴大SHERLOCK系統的輸出信號，他們又引入CRISPR Ⅲ型效應核酸酶Csm6，該核酸酶能被環狀腺苷酸分子或末端含2′、3′-環腺苷酸的線性腺嘌呤同聚物激活[24-25]。研究發現，Cas13蛋白的附屬切割恰好可以產生末端含2′、3′-環腺苷酸的裂解產物，通過Cas13與Csm6偶聯，從而使輸出信號進一步放大。另一方面，為了解決結果讀取依賴于儀器設備的問題，他們用FAM-生物素標記報告基因開發了簡便的檢測試紙條。試紙條進樣端包被捕獲FAM的抗FAM抗體和金納米顆粒綴合物，在試紙條第一反應區固定與生物素具有高親和力的鏈霉素，第二反應區固定能捕獲FAM-抗FAM抗體復合物的物質。如果報告基因被Cas13裂解，試紙條上可出現兩條肉眼可見的條帶，反之只在第一反應區出現條帶。這種讀取結果的方法類似于膠體金的檢測原理，擴展了SHERLOCK V2在缺乏醫療設備的野外或現場病原檢測中的應用。在此基礎上，他們又開發了利用加熱和化學還原法來溶解病毒顆粒及滅活核糖核酸酶的方法—HUDSON[23]，使SHERLOCK系統可直接檢測臨床樣本，而無需DNA或RNA的提取和純化。QIN等[26]將crRNA/Cas13a引入微流控技術，開發了自動化多路復用CRISPR微流控芯片，該檢測體系所需樣本量低至10 μL，檢測時間短至5 min，不經過核酸擴增，檢測靈敏度即可達20 pfu/mL，并可同步檢測24個樣本。

4 CRISPR/Cas14a在核酸檢測中的應用

Cas14a是迄今為止發現的最小的RNA引導核酸內切酶，由400～700個氨基酸組成，比Cas9小兩倍。與Cas12a和Cas13a相同，Cas14切割靶標ssDNA后，也具有非特異性附屬切割活性，可用于單核苷酸突變分型(Cas14-DETECTR)[27]。與其他2類CRISPR效應子不同的是，Cas14a-tracrRNA-crRNA可識別切割任何與之具有20 nt核苷酸互補的靶ssDNA而不受PAM序列的限制。由于該蛋白對種子區中間部位的堿基突變非常敏感且不需要PAM序列的激活，因此該蛋白在基因組單堿基突變檢測方面具有重要的應用價值。

5 CRISPR/Cas系統在核酸檢測中面臨的挑戰

CRISPR/Cas技術在核酸檢測方面已經取得了巨大成就，在核酸快速精準檢測方面具有諸多優勢：(1)通過加熱等簡單地處理包括血液、尿液、分泌物等臨床樣本，而不需要復雜的核酸提取；(2)反應所需的試劑耐受冷凍干燥，便于存儲使用；(3)檢測時間短，一般2 h內即可報告檢測結果；(4)簡單便攜，不依賴于電力和昂貴的儀器；(5)結果讀取方便，通過熒光檢測或肉眼觀察即可讀取檢測結果；(6)檢測靈敏度高，特異性強，可用于單堿基突變檢測；(7)檢測范圍廣，可用于DNA、RNA、甲基化以及蛋白質等檢測。但是，CRISPR/Cas技術在核酸檢測方面仍存在許多障礙和局限，主要表現在以下幾個方面：(1)sgRNA對靶位點的正確識別依賴于PAM序列且不同物種的CRISPR/Cas系統識別不同的PAM序列，雖然這種特性在某種程度上增加了該系統的特異性，但同時降低了靶標的選擇范圍，增加了相應sgRNA的設計難度。LI等[15]通過在HOLMES和HOLMES V2中使用含有PAM的引物將PAM序列引入PCR或LAMP的擴增產物中，使HOLMES和HOLMES V2能夠以不依賴于PAM序列的方式檢測核酸。(2)由于CRISPR/Cas技術的“脫靶”效應，可能導致假陰性。筆者推測，在基因庫中篩選最優的靶標、尋找其他來源的Cas蛋白或CRISPR系統的突變體可能有助于解決“脫靶”問題。隨著未來“脫靶”效應的解決，CRISPR/Cas技術在核酸檢測中的準確性必將得到更大程度地提高。(3)由于自然界中存在大量核糖核酸酶且十分穩定，sgRNA、報告基因RNA等容易被污染而遭到破壞，導致錯誤的檢測結果。(4)CRISPR/Cas技術使用針對已知堿基序列靶標的特異性探針來檢測DNA或RNA，因此檢測新出現的病原體或快速突變的RNA病毒時可能面臨巨大的挑戰。盡管存在這些問題，但CRISPR/Cas技術依然為核酸檢測提供了強大的新工具和新技術。因此，進一步研究以解決CRISPR/Cas技術的局限性將為重大疾病的病原核酸快速精準檢測鋪平道路。

6 總結及展望

目前，核酸檢測一般包括病原體的分離、核酸提取與擴增、檢測結果分析等，耗時長且對醫療設備和操作人員的專業水平要求很高。便攜、快速、低成本、靈敏度高及特異性強的核酸檢測技術對生物學研究和臨床診斷具有非常重要的意義。本文概述的幾種基于CRISPR/Cas技術的核酸檢測證明了該系統不僅具有強大的基因定點編輯能力，而且在分子精準診斷領域具有重要的應用價值。SHERLOCK V2、CRISPR微流控芯片等技術的開發表明CRISPR/Cas系統具有同時檢測多個靶標的潛力。雖然單獨的CRISPR/Cas系統對核酸檢測靈敏度的提升有限，大多數需要跟核酸擴增技術相結合，但研究者發現將CRISPR/Cas系統與生物傳感器相結合，同樣具有極高的靈敏度，并可實現核酸的定量檢測。該系統與其他核酸檢測技術的結合，預示該檢測技術有望不依賴于昂貴設備和專業技術，在現場快速檢測領域具有巨大的應用前景。隨著不斷發現新的Cas蛋白，CRISPR/Cas技術有望實現在分子水平上精確可靠的診斷病原體或鑒別突變癌基因。現階段，實驗室CRISPR/Cas核酸檢測研究與復雜臨床檢測應用環境中的有效性仍有待觀察。為了確保檢測結果可靠準確，基于CRISPR/Cas的核酸檢測技術在進入臨床應用前還需經過更深入的科學研究。隨著眾多科學家的不斷探索和技術上的不斷創新，被譽為“基因魔剪”的CRISPR/Cas技術必將成為核酸精準檢測領域的新寵和利器。