AST參考方法的不同測定模式對測量結果精密度的影響

羅曉旭，秦大鵬，申 彬，梁轉霞，杜怡青，楊澤華△

(1.山西醫科大學，山西太原 030001；2.山西醫科大學第六醫院檢驗科，山西太原 030008)

精密度是指在規定條件下對同一或類似被測對象重復測量所得示值或測得值間的一致程度，是臨床生物化學方法學性能評價的關鍵指標之一[1]，可反映測定結果的離散程度。天門冬氨酸氨基轉移酶(AST)作為臨床酶學常測定的指標之一，對于心臟與肝臟等多種疾病的診斷具有重要的臨床意義[2]。現在臨床實驗室在多數情況下為單次檢測發出報告，因而提高實驗室AST測量結果的精密度就尤為重要。國際臨床化學標準協會已于2002年發布了關于酶學標準化程序的七部系列文件，其中第五部分即AST的參考方法[3]，該方法對影響AST活性的因素進行了詳細規定，如試劑的種類、緩沖液的性質、反應體系的溫度、酸堿度、波長等[4-5]，但其在讀點時間周期方面僅表述為“檢測時間180 s，讀點≥6”、在混勻時間方面僅表述為“充分混勻”[5]，并未作具體說明。AST參考測量過程分為3個階段：溫育期、延遲期、測定期。在溫育期，由于還未加入啟動試劑，酶促反應還未開始，此時的反應體系理論上不需要混勻。在測定期即在比色時進行混勻會使反應曲線有一定程度上的“漂移”，并對測定結果造成影響[7]。因此本實驗將從延遲期的混勻時間及讀點時間周期方面設計不同的AST測定模式，對AST參考方法的最佳測定模式進行探討，優化參考方法的測定模式，提高AST測定結果的穩定性。

1 材料與方法

1.1樣本 Randox質控血清，批號為1092UN；嚴格按照質控血清復溶說明溶解及混勻質控品。

1.2儀器與試劑 紫外分光光度計及其配套比色皿、比色杯恒溫電子控制裝置、電子天平均購自日本Shimadzu公司；恒溫水浴箱、pH計、Finnpipette移液器、電子溫度計、秒表、容量瓶及各種高精密度玻璃器皿等購自中國北京化工公司；按照國際臨床化學與檢驗醫學聯合會(IFCC)推薦的AST參考測量程序配制試劑。還原型-β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸二鈉鹽(NADH)、乳酸脫氫酶(LDH)均購自美國Sigma公司；氯化鈉(NaCl)、疊氮鈉(NaN3)、氫氧化鈉(NaOH)、鹽酸(HCl)購自中國北京化工公司；三羥甲基氨基甲烷(Tris)、L-天門冬氨酸、α-酮戊二酸二鈉鹽、乳酸脫氫酶(LDH)、蘋果酸脫氫酶(MDH)、丙酮酸鈉、牛血清白蛋白均購自中國上海生工有限公司。配制成反應液R1，啟動液R2。

1.3方法

1.3.1質控品的溶解方法 按照質控品復溶要求將Randox凍干粉質控品用5 mL去離子水在室溫下溶解混勻呈均一態，以每0.5 mL分裝于小型離心管中，-20 ℃保存；室溫復溶且復溶1次；開啟瓶塞時應嚴格避免凍干粉的丟失[8]。

1.3.2測定模式的設計 按照讀點時間周期及混勻時間的不同將AST共設計為A～I共9種不同的測定模式。模式A：讀點時間周期15 s，混勻時間30 s；模式B：讀點時間周期15 s，混勻時間45 s；模式C：讀點時間周期15 s，混勻時間60 s；模式D：讀點時間周期30 s，混勻時間30 s；模式E：讀點時間周期30 s，混勻時間45 s；模式F：讀點時間周期30 s，混勻時間60 s；模式G：讀點時間周期18 s，混勻時間30 s；模式H：讀點時間周期18 s，混勻時間45 s；模式I：讀點時間周期18 s，混勻時間60 s。

1.3.3樣本檢測方法 依照IFCC參考測量程序建立AST改良參考方法，為不加磷酸吡哆醛方法，依照上述測定模式對樣本進行檢測，每天對每種模式重復測定2次，間隔時間大于2 h，連續測定20 d[9]。樣本在規定的反應條件下進行測定：溫度(37.0±0.1)℃；波長340 nm；頻帶寬度≤2 nm；光路10.00 mm；孵育時間360 s；延遲時間90 s；檢測時間180 s。

1.4統計學處理 匯總不同測定模式的全部數據，利用Excel軟件計算在每種測定模式下的AST測定結果及總不精密度(CV總)并進行比較，判斷測量結果精密度是否符合參考方法精密度要求[10]。

2 結 果

圖1 AST 動力學反應曲線

表1 不同測定模式下AST測量結果及其精密度

2.2不同條件下的AST測量結果及其精密度 結果發現：測定模式B即讀點時間周期為15 s、混勻時間為45 s的測定模式的AST測量總不精密度最小，且小于1%，符合參考方法精密度要求；讀數時間周期相同時，延遲期混勻時間為45 s的測定模式下測量總不精密度最小；延遲期混勻時間相同時，讀數時間周期為15 s的測定模式下測量總不精密度最小。見表1～3。

表2 不同讀點時間周期的測定模式下AST測量結果及其精密度

表3 不同混勻時間的測定模式下AST測量結果及其精密度

注：偏倚指測定結果均值與質控品所示目標值的偏倚。

3 討 論

臨床生化檢驗為臨床實驗室工作的重要內容，其中臨床酶學檢驗又為臨床生化檢驗的重要組成部分。精密度是檢驗系統重要的分析指標，是檢驗結果準確度的前提[11-12]，臨床醫師看重的是同一份標本在不同檢測時間段的重復性，如果同一份標本在不同檢測時間段的檢測結果差異很大，臨床醫生及患者就會不相信實驗室的檢測結果[13]，從而影響臨床決策、患者安全及檢驗科自身的發展。因此，提高檢測結果的精密度，保證分析性能滿足臨床檢測要求是檢驗室日常工作的重要一部分。

本實驗從AST的讀點時間周期及延遲期的混勻時間著手，探討不同測定模式對AST測量結果精密度的影響。從實驗結果來看，在讀點時間周期為15 s、延遲期混勻時間為45 s的測定模式B下，AST的測量結果不精密度最小，為0.69%，小于參考方法設定目標值。按照讀點時間周期的不同將9種測定模式分為3組可以發現，每組中即讀點時間周期相同的情況下，不精密度最小的為混勻時間為45 s的混勻模式，而混勻時間為30 s和60 s時精密度不好可能是因為混勻時間過短和混勻時間過長。混勻時間過短會造成反應體系混勻不充分，而混勻時間過長影響精密度可能有兩方面原因：(1)檢測時間段一致的情況下，混勻時間過長則反應體系靜止時間縮短，即在反應體系還未穩定時即開始進行比色測定，直接影響測定結果的穩定性[5]；(2)半自動生化分析儀加R2試劑時需開蓋，這樣室溫就會影響比色杯內反應體系的溫度[14]，且混勻時間越長，對反應體系的影響就越大。按照延遲期混勻時間的不同將9種測定模式繼續分為3組可以看出，每組中即在延遲期混勻時間相同的情況下，讀數時間周期為15s的測定模式下AST測定不精密度最小，可能原因為讀數時間周期越短，相同檢測時間段內所讀取的點越多，采用線性回歸計算單位時間內吸光度變化所得值就越接近。另外，參考方法為純手工操作，因此酶學測定結果還會受實驗室環境、操作人員等的不同的影響[15-16]，不同實驗室的酶學最佳測定模式也可能有所不同。

從本實驗結果來看，測定模式的差異對AST測量結果精密度有明顯的影響，不同酶學指標的精密度最好的測定模式可能不同。實驗室應探索適合自己的酶學測定模式，對每個酶學指標的測定模式進行具體探討，完善參考測定程序中的測定條件，提高酶學測量結果的精密度。