細胞程序性死亡-配體1基因啟動子區rs10815225多態性與結直腸癌的關聯研究

馬曉骉，張 麒，潘定國

(云南省腫瘤醫院：1.生物治療中心；2.腹部外科；3.結直腸外科，云南昆明 650118)

免疫療法是當前最具前景的腫瘤治療方法之一。細胞程序性死亡-受體1(PD-1)/細胞程序性死亡-配體1(PD-L1)是腫瘤免疫治療的一個重要靶點，兩者結合可抑制抗腫瘤免疫應答[1-2]。PD-L1在人類多種腫瘤，包括結直腸癌中呈高表達，與淋巴結轉移和預后等臨床特征密切相關，影響細胞的增殖、凋亡、侵襲和遷移[3-10]。有研究顯示，PD-L1基因啟動子區rs10815225不同等位基因與轉錄因子SP1的結合不同，導致不同個體對胃癌的易感性不同[11]。鑒于rs10815225是一個功能性多態位點，推測該位點多態性可能與結直腸癌的風險有關。本研究運用病例-對照研究調查rs10815225多態性與中國漢族人群結直腸癌的關聯，并分析其對轉錄活性和PD-L1 mRNA的影響。

1 資料與方法

1.1一般資料 血液樣本：收集2012年3月至2017年5月在本院住院的結直腸癌患者215例作為病例組，同期收集本院體檢健康者236例作為對照組。兩組研究對象均來自云南地區，均為漢族個體，相互間無親緣關系，性別和年齡差異無統計學意義(P>0.05)；病例組中飲酒和吸煙個體均高于對照(P≤0.05)。結直腸癌納入標準：(1)經醫院病理科確診；(2)未經放、化療治療者。結直腸癌排除標準：(1)結直腸癌術后復發者；(2)非原發性結直腸癌者；(3)有家族史者。215例病例中，高、中分化158例，低分化57例；臨床Ⅰ～Ⅱ期108例，臨床Ⅲ～Ⅳ期107例。采集外周靜脈血2～3 mL，乙二胺四乙酸抗凝，-20 ℃冰箱保存備用。組織樣本：手術切除結直腸癌組織樣本65例，離體樣本經液氮速凍，-80 ℃冰箱保存備用，所有樣本均經醫院病理科確診。本研究經醫院倫理委員會批準。見表1。

表1 病例組和對照組臨床資料

1.2試劑與儀器 引物由中國擎科生物科技有限公司合成；基因組DNA提取試劑盒、DNA分子量標準、聚合酶鏈反應混合物、Trizol試劑、TIANScript Ⅱ反轉錄試劑盒和SYBR Green熒光定量PCR試劑盒均購自中國北京天根生化科技有限公司；限制性內切酶Kpn Ⅰ和Xho Ⅰ購自美國NEB公司；pGL3載體和定點突變試劑盒購自美國Promega公司；熒光定量PCR儀購自德國Eppendorf公司。

1.3方法

1.3.1DNA抽提及rs10815225多態性分析 基因組DNA通過試劑盒法抽提。直接測序法分型rs10815225。測序引物序列如下：上游5′-CGA AGG TCA GGA AAG TCC AA-3′，下游5′-AGG AAC AAC GCT CCC TAC CT-3′。PCR總反應體系50 μL，其中2×PCR緩沖液25 μL，上、下游引物各2 μL，基因組DNA 2.5 μL和去離子水18.5 μL。反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s；60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環；72 ℃充分延伸10 min，4 ℃保存。PCR反應產物送中國擎科生物科技有限公司測序。

1.3.2實時熒光定量PCR檢測PD-L1 mRNA表達 Trizol法提取結直腸癌組織總RNA，按照反轉錄試劑盒和熒光定量PCR試劑盒說明書操作進行PD-L1 mRNA相對水平分析。PD-L1引物：上游5′-GGT GGT GCC GAC TAC AA-3′，下游5′-TAG CCC TCA GCC TGA CAT-3′。內參基因選用甘油醛-3-磷酸脫氫酶，上游引物：5′-ATG GGG AAG GTG AAG GTC G-3′，下游引物：5′-GGG GTC ATT GAT GGC AAC AAT A-3′。PCR反應總體系10 μL，含2×SYBR Green 5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL和去離子水2 μL。反應條件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30s，60 ℃ 35 s，40個循環。記錄目的基因和內參基因的循環閾值(Ct)，采用2-ΔCt法計算不同rs10815225基因型結直腸癌患者中PD-L1 mRNA的相對表達量。

1.3.3雙熒光素酶活性檢測 參考文獻[11]構建pGL3-rs10815225G和pGL3-rs10815225C重組載體。以rs10815225GG純合子DNA為模板擴增PD-L1啟動子區，上游引物：5′-GGC TAG GGT ACC CGT TCA GAT GTT GGC TTG TTG-3′，下游引物：5′-GGC TAG CTC GAG GGA AGC TGC GCA GAA CTG GGG-3′。經KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切，連接pGL3載體，構建pGL3-rs10815225G重組載體。運用定點突變試劑盒將G突變為C，突變引物：5′-GAC CCC GCC TCC CGG CCT GGC GCA AC-3′。提取質粒，獲得pGL3-rs10815225C重組載體。高糖DMEM培養基培養結直腸癌細胞HCT116，接種于24孔板，Lipo2000轉染pGL3、pGL3-rs10815225G和pGL3-rs10815225C載體，pRL共轉染，48 h后檢測熒光素酶活性。

2 結 果

2.1HWE檢驗 入選病例組和對照組研究個體PD-L1基因啟動子區rs10815225基因型分布符合HWE定律，P>0.05。

2.2PD-L1基因啟動子區rs10815225多態性與結直腸癌的相關性 對照組中，PD-L1基因啟動子區rs10815225GG和CG基因型頻率分別為80.5%和19.5%；疾病組中，頻率分別為89.3%和10.7%。Logistic回歸結果顯示，調整性別、年齡、飲酒和吸煙因素后，與GG基因型相比，CG基因型降低結直腸癌患病風險(OR=0.48，95%CI0.28～0.83，P=0.01)。對rs10815225基因型頻率按照分化程度和TNM分期進行分層分析，Logistic回歸結果顯示，rs10815225多態性與以上臨床特征無相關性(P>0.05)。見表2。

表2 PD-L1基因啟動子區rs10815225多態性與結直腸癌的相關性

2.3rs10815225多態性對熒光素酶活性和PD-L1 mRNA的影響 結直腸癌HCT-116細胞轉染空質粒pGL3、pGL3-rs10815225G和pGL3-rs10815225C，48h后檢測雙熒光素酶活性。與空質粒pGL-3相比，轉染pGL3-rs10815225G和pGL3-rs10815225C后熒光素酶活性均明顯增加。與pGL3-rs10815225G相比，轉染pGL3-rs10815225C后熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)。PD-L1 mRNA在rs10815225GG基因型結直腸癌患者中的相對表達量為0.64，在rs10815225CG基因型患者中的相對表達量為0.06。兩組相比，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖1B。

注：A表示結直腸癌HCT-116細胞轉染空質粒pGL3、pGL3-rs10815225G和pGL3-rs10815225C48 h后，熒光素酶活性，*P<0.05；B表示rs10815225GG和CG基因型結直腸癌患者中PD-L1 mRNA的表達差異，*P<0.05。

圖1rs10815225多態性對熒光素酶活性和PD-L1mRNA的影響

3 討 論

PD1/PD-L1，作為重要的免疫檢查點，在腫瘤免疫治療中的作用備受矚目[12-16]。PD1表達于多種免疫細胞，例如細胞毒性T淋巴細胞、B細胞和單核細胞等。PD-L1作為PD1的配體，傳遞細胞信號抑制T細胞活化和增殖，介導自身免疫耐受。多種腫瘤細胞表面表達PD-L1，與PD1結合，抑制細胞毒性T淋巴細胞的殺傷作用及細胞因子的釋放，從而導致腫瘤細胞發生免疫逃逸[3-7]。基于PD-L1在腫瘤免疫中的重要作用，該基因上的遺傳變異可能成為腫瘤發生和預后的一個生物學標記物。

最近，TAO等[11]報道了位于PD-L1基因轉錄起始位點上游62 bp的一個功能性多態位點rs10815225C/G，G等位基因可與轉錄因子SP1結合，而C等位基因則不能，造成攜帶CG基因型胃癌患者中PD-L1 mRNA表達明顯降低，進而降低胃癌的發病風險。隨后，有研究報道該多態性與PD-L1蛋白表達和胃癌的預后無關[17]。由于遺傳多態性與結直腸癌的發病有關，例如脂聯素基因rs2241766位點、環氧化酶-2基因-765G/C位點、HIPPO通路RASSF1A基因rs2236947位點、白細胞介素17Ars10484879位點、髓過氧化物酶基因啟動子區rs2333227位點和miR-17-92啟動子區rs9588884和rs982873位點等[18]。因此，推測PD-L1基因多態性可能影響結直腸癌的易感性個體差異。本研究回顧性調查了rs10815225在215例結直腸癌和236例對照組中的分布，發現CG基因型攜帶者結直腸癌的發病風險降低50%，提示可能是結直腸癌的保護因素之一。以往全基因組關聯研究證實，9p24是結直腸癌的1個易感位點[19]，PD-L1基因恰好位于該易感區域(9p24.1)，由此認為本研究結果具有一定的理論研究支持，合理可靠。

為了探討rs10815225CG基因型降低結直腸癌風險的可能機制，本研究運用雙熒光素酶報告基因檢測系統和實時熒光定量分析了rs10815225對基因轉錄活性和PD-L1 mRNA的影響，發現與rs10815225G等位基因相比，rs10815225C等位基因對應的細胞轉錄活性顯著降低，導致PD-L1 mRNA表達下調，結直腸癌的發病風險降低。該研究結果與TAO等[11]在胃癌中觀察到的結果一致，證實了由于rs10815225C等位基因不能與轉錄因子SP1結合，致使轉錄活性下降，具有促癌作用的PD-L1 mRNA水平降低，最終導致結直腸癌的罹患風險減小。

本研究亦存在一定的局限性，臨床樣本采集時未考慮一些混雜因素，比如體質指數、飲食習慣(油炸煙熏及腌制食品)、吸煙是否被動等，因此無法校正更多的混雜因素，基因—環境相互作用值得進一步深入研究。

4 結 論

PD-L1基因啟動子區rs10815225CG基因型通過降低基因轉錄活性和PD-L1 mRNA表達，進而降低中國漢族人群結直腸癌的發病風險，提示rs10815225可能作為結直腸癌新的免疫治療靶點。