miRNA-10b與乳腺癌相關腫瘤標志物在早期乳腺癌中診斷效能比較*

姚 穎，陸奎英，張 敏，丁昌平

(揚州大學附屬醫院檢驗科，江蘇揚州 225002)

乳腺癌多發生于乳腺導管上皮中，在女性惡性腫瘤中，發病率較高。目前乳腺癌診斷的金標準為組織病理學染色，輔助診斷檢查包括有影像學檢查乳腺X鉬靶照相及血清學檢查乳腺相關腫瘤標志物[1-2]。病理活檢及影像學檢查在區分正常乳腺組織及乳腺惡性腫瘤中均有較高的準確率及特異性，但在方法學上存在限制性，包括病理標本取材創傷、放射性污染及高昂的檢測費用等。因此尋找特異性血清學乳腺癌標志物輔助診斷，對準確篩查出早期乳腺癌有積極的臨床意義。傳統乳腺癌血清診斷指標包括：癌胚抗原(CEA)、糖類抗原153(CA153)、糖類抗原199(CA199)和糖類抗原125(CA125)等，其余標志物在乳腺癌患者中水平也有變化，但特異性不佳。研究表明，在Ⅰ/Ⅱ期乳腺癌患者中，CA153水平升高不明顯對早期乳腺癌的診斷效能靈敏度不理想[3]。近年來發現微小核糖核酸(miRNA)在腫瘤的發生、發展及轉移中起重要作用，其中微小核糖核酸-10b(miRNA-10b)與乳腺癌的惡性程度緊密相關，miRNA-10b可作為早期乳腺癌篩查的理想血清學指標[4]。本項研究評估了miRNA-10b及幾項傳統血清腫瘤標志物在健康人群、乳腺良性疾病、乳腺惡性腫瘤早期及晚期患者組織中的表達，并探討上述指標在早期乳腺癌中的診斷效能，報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015 年7 月至2017 年12月本院門診及住院的乳腺疾病女性患者92例。其中乳腺癌患者50例，年齡39～68歲，平均(42.64±13.47)歲，早期乳腺癌患者30例、晚期乳腺癌患者20例。乳腺良性疾病患者42例(乳腺增生15例、乳腺纖維瘤8例、乳腺炎19例)，年齡21～59歲，平均(38.64±12.12)歲。另選健康對照者50例，均為體檢合格女性，年齡22～65歲，平均(39.64±10.23)歲。四組受試者的年齡、體質量指數、吸煙、喝酒等一般資料差異無統計學意義，具有可比性(P>0.05)。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2方法

1.2.1診斷標準 乳腺良性疾病：經病理學鑒定排除乳腺癌惡性腫瘤可能。乳腺增生：伴有一側或兩側出現單個或多個腫塊，患有周期性乳房脹痛，月經后腫塊及疼痛緩解[3,5]。乳腺炎：伴有乳房脹痛腫塊，皮膚微紅，體溫可能升高，中性粒細胞可能升高[6]。乳腺纖維瘤：乳房腫塊無痛性，多為圓形，超聲提示境界清楚，邊緣整齊，活動度較大[7]。乳腺癌：病理檢查確診乳腺浸潤性導管癌，入組患者為新發乳腺癌未經手術及放療、化療藥物治療。50例乳腺癌患者按TNM分期為Ⅰ、Ⅱ期的患者30例，Ⅲ、Ⅳ期患者20例[8]。

1.2.2miRNA檢測 所有受試者空腹采集靜脈血2 mL于乙二胺四乙酸抗凝管中，取抗凝全血300 μL，加入miRNA提取液，參照說明書步驟，提取總RNA。將提取到的RNA進行逆轉錄，反應體系如下：模板RNA 6 μL；100 mM dNTPs 0.3 μL；10×RT Buffer 1.5 μL；RNase Inhibitor(20 U/μL)0.19 μL；ddH2O 1.01 μL。反應條件：16 ℃ 30 min；42 ℃ 30 min；85 ℃ 5 min；4 ℃結束。以U6做實驗內參，行熒光定量PCR法擴增實驗，反應體系為：TaqMan Master Mix 2×12.5 μL； Primer 3.75 μL；ddH2O 6.25 μL。反應條件：95 ℃ 10 min；55 ℃ 2 min；72 ℃ 2 min；95 ℃ 15 s；60 ℃ 4 min；循環12次，99.9 ℃ 10 min；4 ℃結束。實驗重復3次，反應體系中熒光信號達到所設定閾值所經歷的循環數即為循環閾值(Ct)，以U6為內參，采用2-△△Ct計算miRNA-10b的相對表達水平，即△Ct=Ct目的基因-CtU6。

1.2.3血清CEA、CA153、CA199和CA125檢測 患者空腹采集靜脈血5 mL，3 000 r/min，離心5 min，沉淀后分離血清，等待檢測。采用電化學發光法進行檢測，使用羅氏全自動電化學發光儀及其配套試劑盒，嚴格執行各項質控標準。各項指標參考范圍如下：CA153<25 U/mL，CA199<34 U/mL，CA125<35 U/mL。

2 結 果

2.1各組血清CEA、CA153、CA199、CA125、miRNA-10b表達水平比較 健康對照組及乳腺良性疾病組患者血清中CEA、miRNA-10b及3組乳腺癌相關腫瘤標志物表達水平顯著低于乳腺惡性腫瘤組，差異有統計學意義(P<0.05)。在早期乳腺癌組患者血清中，CA153及miRNA-10b的表達水平均有明顯升高，水平與晚期乳腺癌患者組相當，差異無統計學意義(P>0.05)。其余血清腫瘤標志物表達略有升高，高于健康對照組及乳腺良性疾病組，低于晚期乳腺癌組，且差異有統計學意義(P<0.05)，見表1。

2.2各指標在兩兩鑒別健康對照組、早期乳腺癌組及晚期乳腺癌組中的診斷效能評價 血清CEA、CA153、CA199、CA125、miRNA-10b在鑒別診斷健康對照組與晚期乳腺癌組的AUC均高于0.80，且差異有統計學意義(P<0.05)，能較好鑒定出乳腺癌，特異度高，靈敏度稍低。其中CA153及miRNA-10b的診斷效能最佳，臨界診斷值分別為1.8 ng/mL及4.52 U/mL。上述血清指標對健康對照組及早期乳腺癌診斷效能的分析結果顯示，除miRNA-10b及CA153外，其余幾項血清腫瘤相關指標均無法鑒別早期乳腺癌。miRNA-10b在早期乳腺癌的鑒別診斷表現優于乳腺癌特異性腫瘤相關抗原CA153，其診斷AUC為0.97，特異度達到100%，見表2、3及圖1、2。

表1 不同指標在各組中表達水平比較

注：與健康對照組比，*P<0.05；與乳腺良性疾病組比，△P<0.05；與早期乳腺癌組比，#P<0.05。

表2 各指標對健康對照及晚期乳腺癌組鑒別診斷效應評價

表3 各指標對健康對照及早期乳腺癌組鑒別診斷效應評價

圖1 血清CEA、CA153、CA199、CA125和miRNA-10b在健康對照組與晚期乳腺癌組的診斷ROC

圖2 血清CEA、CA153、CA199、CA125和miRNA-10b在健康對照組與早期乳腺癌組的診斷ROC

2.3多元Logistic回歸分析各指標與乳腺癌的關系 以健康對照組及乳腺癌組做二分類變量，運用多元Logistic回歸模型對上述指標進行分析。結果顯示CA153及miRNA-10b水平升高是乳腺癌發生的獨立危險因素OR=1.09、12.47；95%CI為1.05～1.13、2.62～59.34，見表4。

表4 多元Logistic回歸分析各指標與乳腺癌惡性的關系

3 討 論

目前已經發現多種與乳腺癌相關的血清標志物，如CEA、CA153、CA199和CA125[9]，但同時分析四項血清標志物用于鑒別診斷乳腺良性疾病、乳腺癌及乳腺癌的早晚期報道較少。CA153是從轉移性乳腺癌中分離出的一種腫瘤相關抗原，在健康對照組中表達低，乳腺癌組中表達增高，CA153的表達與治療效果、臨床分期、腫瘤大小及腋窩淋巴結狀況密切相關，對健康人群與早晚期乳腺癌患者的鑒別診斷效能高于其余腫瘤指標且特異性高[10]，TANG等[11]、LI等[12]通過Meta分析表明CA153可用于鑒別乳腺癌和健康人群。CEA是一種胚胎性抗原，同時存在于消化道腫瘤、肺癌等多種惡性腫瘤中，在乳腺癌患者血清中也可檢測到CEA過量表達。CEA作為廣譜腫瘤標志物，表達受全身多組織微環境影響，因此，對乳腺癌診斷的特異度及靈敏度均低于CA153[13]，如WANG等[9]研究顯示乳腺癌外周血的CEA陽性比例低于CA153。抗原存在于上皮性卵巢癌細胞中，是一類可與OC125結合的糖類抗原，常被視作卵巢上皮癌的腫瘤標志物應用于臨床，在惡性乳腺腫瘤患者中也有表達，陽性率稍低與卵巢癌。CA125 AUC小于CA153，特異較差[14]。CA199常作為胰腺癌、膽囊癌等惡性腫瘤的輔助診斷指標，同時在乳腺癌患者中也可高表達，與CA125類似，CA199單獨用作乳腺癌的診斷特異性較差[15]。CEA、CA199及CA125均非乳腺癌特異性的腫瘤標志物，盡管在晚期乳腺癌患者表達升高，陽性率并不理想。早期乳腺癌患者中，除CA153，其余腫瘤標志物水平僅有輕微升高，無法作為早期乳腺癌的篩查指標,WANG等[16]研究也表明CA125和CA199不可用于診斷惡性胸腔積液。

作為miRNA家族成員之一，miRNA-10b是非編碼單鏈小RNA分子，定位于2號染色體3區1帶，與乳腺癌惡性程度高度相關，是首先被鑒定出的在轉移性乳腺癌細胞系中高度特異性表達的miRNA之一[17]。本研究發現，與健康對照組比較，miRNA-10b在乳腺良性疾病組中表達略有升高，但差異無統計學意義。而在早期及晚期乳腺癌組中，miRNA-10b表達均顯著升高，成為篩選早期乳腺癌的理想指標(AUC=0.97)，優于乳腺癌特異性腫瘤指標CA153，為其余血清腫瘤相關指標所不能及。本研究中所報道的miRNA-10b在篩查早期乳腺癌患者中具有較高的準確率，是體檢中篩查早期乳腺癌的理想血清學指標[14]。miRNA-10b的表達變化與乳腺癌細胞的侵襲及轉移也密切相關。基礎實驗結果表明，將乳腺癌細胞移植至小鼠的乳腺脂肪墊中，可在肺部、食道、胰腺等組織中檢測到癌細胞轉移，可能的機制在于miRNA-10b介導了Twist誘導的上皮間質轉化、抑制抑癌基因的翻譯和激活細胞遷徙及細胞外基質的重塑基因，進一步證實miRNA-10b可作為抗乳腺癌轉移的一個潛在靶點及預后標志物[4]。

4 結 論

miRNA-10b在乳腺癌患者中特異性表達，在臨床上可作為篩查早期乳腺癌的理想血清學指標，其診斷效能優于傳統的乳腺癌相關腫瘤標志物。然而對乳腺癌的診斷，也不應忽視基本臨床觸診與影像學檢查的結合及病理染色的確認，最大程度減少臨床誤診、漏診。