SV2A基因真核表達質粒構建及其在HEK293T細胞中的表達*

張曉敏，王培昌，劉 靜

(首都醫科大學宣武醫院檢驗科，北京 100053)

突觸神經遞質釋放功能障礙與各種中樞神經系統疾病的發病機制密切相關，突觸的數量改變也與許多腦部疾病有關[1-2]，如阿爾茨海默病、癲癇等疾病[3-4]。突觸囊泡蛋白2A(SV2A)是一種膜蛋白，特異性表達于突觸囊泡中，主要調節腦內動作電位依賴性神經遞質釋放。研究發現，SV2A與癲癇的發病機制及治療存在密切聯系，SV2A基因敲除小鼠出生后不久即表現出嚴重的癲癇發作[5]。據報道，不同類型的癲癇動物和癲癇患者腦內SV2A蛋白表達水平均有不同程度的改變，以SV2A為治療靶點的抗癲癇藥物左乙拉西坦及其類似物目前已被廣泛應用于臨床[6-8]。然而SV2A調控癲癇的作用機制仍未可知，為了進一步研究SV2A基因在癲癇等神經系統疾病中的功能，本文構建了鼠SV2A基因的真核表達質粒，并在HEK293T細胞中進行了表達與鑒定，旨在為進一步研究SV2A在神經系統疾病中的機制及作用提供依據。

1 材料與方法

1.1材料 真核表達載體p3×Flag-CMV-10和HEK293T細胞均為中科院生物物理研究所惠贈；菌株Top10感受態細胞、DNA回收試劑盒、質粒小提試劑盒、T4 DNA連接酶、500 bp DNA ladder和D15000+2000 DNA ladder購自中國北京Tiangen公司；HindⅢ、EcoRⅠ限制性內切酶、CutSmart購自美國NEB公司；5×All-In-One RT Master Mix購自加拿大Abm公司；Trizol、Lipo3000購自美國Invitrogen公司；DMEM培養基、胎牛血清、雙抗購自美國Gibco公司；BCA蛋白水平測定試劑盒、5×Tris-甘氨酸蛋白電泳緩沖液、10×電轉液、5×蛋白上樣緩沖液購自中國北京Solarbio公司；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜購自美國Millipore公司；抗Flag抗體購自美國Sigma公司；抗β-actin抗體及對應二抗購自中國北京中杉金橋公司；PCR儀購自美國ABI公司；高速冷凍離心機購自德國Eppendorf公司；電泳儀購自美國Bio-Rad公司；曝光儀購自中國上海天能科技有限公司。

1.2方法

1.2.1獲得cDNA 用Trizol法提取APP/PS1雙轉基因小鼠海馬組織RNA[9]，用逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA：以RNA為模板，加入5×All-In-One RT Master Mix。PCR程序為：25 ℃ 10 min；42 ℃ 15 min；85 ℃ 5 min；冷卻至4 ℃，即獲得模板cDNA。

1.2.2獲得目的基因 依據GenBank數據庫中鼠SV2A(基因ID:64051)基因mRNA的序列(NM_022030.3)，設計巢式PCR引物，應用Primer-Blast設計第1對引物，引物序列為F1:5′-TCC AGG CCC TAG TTC CTC TC-3′，R1:5′-TGT GCC TGC CAT CCC TAA AG-3′。根據基因編碼區序列設計第2對引物，分別在上下游引物中加入HindⅢ和EcoRⅠ酶切位點，并加入相應的保護堿基，引物序列為：F2:5′-CCC AAG CTT ATG GAA GAA GGC TTT CGA GAC -3′，R2:5′-GGA ATT CTC ACT GCA GCA CCT GTC C-3′。引物由中國生工生物工程技術服務有限公司合成。以cDNA為模板，分別以F1、R1和F2、R2為引物，進行兩輪PCR擴增，條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃變性10 s；56 ℃退火30 s；72 ℃延伸1 min，35個循環；72 ℃ 10 min；冷卻至4 ℃。擴增產物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳分離并在紫外燈下切膠回收目的條帶，回收、純化擴增產物采用Tiangen的DNA回收試劑盒。

1.2.3重組質粒的構建 用限制性內切酶HindⅢ和EcoRⅠ分別對載體p3XFlag-CMV-10和SV2A的基因擴增產物進行雙酶切，酶切體系50 μL。酶切載體時：載體10 μL，10×Cut Smart 5 μL，兩種內切酶各1 μL，體系用ddH2O補齊。酶切目的基因時：DNA產物43 μL，10×Cut Smart 5 μL，兩種內切酶各1 μL。目的基因擴增產物37 ℃孵育2 h，載體孵育時間延長至4～6 h。將全部酶切產物用1%的瓊脂糖凝膠進行電泳分離，并對目的條帶切割回收。將回收的目的基因與載體以3∶1的比例混合，加入T4 DNA連接酶和T4 DNA Buffer，室溫連接1 h。將連接產物轉化至感受態大腸桿菌Top10中，37 ℃ 200 r/min搖菌45 min，將轉化后的菌液接種于加有氨芐青霉素的LB固體培養基，37 ℃孵箱過夜培養。挑取多個單克隆菌落，分別置于10 mL加入氨芐青霉素的LB液體培養基中，37 ℃ 200 r/min搖菌12～14 h，用Tiangen質粒小提試劑盒提取質粒。

1.2.4重組質粒的鑒定 用HindⅢ和EcoRⅠ對重組質粒進行雙酶切，對產物用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，根據酶切片段大小鑒定重組質粒是否構建成功。同時對雙酶切鑒定構建成功的重組質粒送中國上海生工生物工程技術服務有限公司進行基因測序，將測序結果與GenBank中的SV2A的cDNA序列進行比對。

1.2.5重組質粒的表達 在六孔板中培養HEK293T細胞，DMEM培養基中含有10%胎牛血清和1%雙抗(青霉素、鏈霉素)，置于37 ℃，CO2水平為5%的恒溫培養箱中培養。當細胞生長狀態良好，融合度達到70%～90%時，進行瞬時轉染。配制轉染試劑A：125 μL DMEM培養基與5 μL Lipofectamine 3000混合孵育10 min。配制轉染試劑B：125 μL DMEM培養基中加入5 μL P3000和2.5 μg p3×Flag-CMV-10-SV2A質粒或空載體質粒(作為空白對照)。將試劑A與試劑B混合后在室溫下孵育10 min，再加入六孔板的培養基中混勻繼續培養，8 h后換成新鮮配制的完全培養基，37 ℃培養至48 h時收集細胞，加入1%Triton×100裂解蛋白。

1.2.6蛋白質印跡法(Western blot)鑒定 將提取的總蛋白用BCA法測定蛋白水平[10]，各取40 μg蛋白進行聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，并轉移到PVDF膜上(350 mA，2 h)。轉膜結束后裁膜，用TBST緩沖液洗膜3次，每次5 min，然后用5%的脫脂奶粉持續封閉2 h，加入特異性的Flag抗體(1∶1 000)，4 ℃搖床孵育過夜；用TBST緩沖液洗膜，每次5 min，共3次；加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗小鼠的二抗(1∶10 000)，室溫孵育1 h，再用TBST緩沖液洗膜3次，每次5 min。加入電化學發光液后曝光。以β-actin作為內參。

2 結 果

2.1SV2A全序列經PCR擴增后電泳鑒定 SV2A基因經PCR擴增后對產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，利用紫外凝膠電泳成像系統分析，對照DNA Marker，在2 239 bp左右可見1條清晰條帶，與預期目的條帶大小一致，見圖1。

注：M表示蛋白標準帶；1表示SV2A基因擴增條帶；2表示空白對照。

圖1SV2A基因擴增產物

2.2重組質粒p3×Flag-CMV-10-SV2A的酶切鑒定及測序 重組質粒p3×Flag-CMV-10-SV2A經HindⅢ和EcoRⅠ酶切后進行1%的瓊脂糖凝膠電泳，經凝膠電泳成像系統分析，可見位于2 239 bp處的SV2A目的基因片段和6 200 bp左右處的p3×Flag-CMV-10載體片段，說明SV2A基因已成功插入p3×Flag-CMV-10載體中，且陽性菌落測序后與GenBank檢索的SV2A的cDNA序列進行比對，結果證明SV2A正確插入p3×Flag-CMV-10載體，見圖2、3。

注：M表示蛋白標準帶；1表示轉染重組質粒條帶；2表示空白對照。

圖2p3×Flag-CMV-10-SV2A的酶切鑒定

圖3 SV2A測序結果

2.3Western blot分析SV2A蛋白在HEK293T細胞的表達 質粒轉染48 h后收集細胞，裂解后提取蛋白，Western blot結果顯示轉染p3×Flag-CMV-10-SV2A質粒的HEK293T細胞在82×103左右處可見1條明顯條帶，與預期結果相符，轉染空載體p3×Flag-CMV-10的HEK293T細胞及空白對照組細胞未見SV2A蛋白表達，見圖4。

注：M表示DNA標準帶；1表示重組質粒擴增條帶；2表示轉染空載體條帶；3表示空白對照。

圖4SV2A在HEK293T細胞中的蛋白表達

3 討 論

SV2A是突觸囊泡蛋白2的家族成員之一，該蛋白家族還包括SV2B和SV2C，這3種同源基因均表達于神經元和內分泌細胞的囊泡中。其中SV2A是分布最廣泛的一種亞型，主要分布于腦組織中，包括大腦皮層、海馬和小腦等部位。它能夠調節動作電位依賴的神經遞質的釋放，維持突觸囊泡穩態，并參與內分泌囊泡的胞吐作用[11-12]。人類SV2A基因位于1號染色體長臂的2區1帶(1q21.2)，包含14 565個堿基對，編碼了一段有13個外顯子的約4 353個堿基對的mRNA，翻譯成相對分子質量約為82.6×103的蛋白，共包含742個氨基酸[13]。SV2A有一段長而保守的N-末端序列，其中前57個氨基酸是與突觸結合蛋白-1(SYT-1)C2B結構域相互作用的部位，SYT-1是一種Ca2+感受器，二者結合可以調節突觸的胞吐作用。SV2A共有12個跨膜結構域，其中第6、7跨膜結構域之間有1個凸向胞質內的大環結構，第7、8跨膜結構域之間有1個凸向囊泡腔內的大環結構，后者有3個N-糖基化位點，這3個位點對于神經肉毒素BoNT/A和BoNT/E進入神經元至關重要[14-15]。

本實驗過程中利用巢式PCR技術擴增目的基因，巢式PCR需要設計2對引物，通過第1對引物擴增出的產物比目的DNA片段長，第2對引物又稱巢式引物，因其擴增的目的片段位于第1對PCR擴增產物的內部而得名，非目的片段與兩套引物同時結合的可能性很小，因此通過該引物可特異性的擴增出位于首輪PCR產物內部的DNA片段。質粒構建過程中載體的選擇至關重要，p3×Flag-CMV-10是一種常用的帶有3×Flag標簽的真核表達載體，它具有許多優勢可保證基因穩定高效的表達，普通的Flag標簽含8個氨基酸殘基，而3×Flag標簽含22個氨基酸殘基，位于融合蛋白的外表面，具有很高的免疫靈敏度，便于檢測和純化目的蛋白；功能強大的CMV啟動子能夠驅動目的蛋白高水平表達；多克隆位點便于目的基因插入；具有多種限制性酶切位點可供選擇；內有Neo抗性標記，可用G418篩選成功轉染了重組質粒的細胞；既可用于瞬轉也可用于穩轉。上述獨特的結構優勢可保證目的基因在哺乳動物細胞內穩定高效表達且便于檢測。HEK293T細胞來源于人胚胎腎上皮細胞，是一種常用的研究外源基因表達的細胞株，細胞增殖速度快，貼壁生長，但其貼壁強度較低，因此換液時應格外小心。易于轉染和穩定表達的特性使其成為一種強大的研究基因功能的工具細胞而被廣泛應用。本實驗也選用了HEK293T細胞作為驗證基因表達效果的細胞，結果表明，轉染效果理想，重組質粒p3×Flag-CMV-10-SV2A成功轉染HEK293T細胞，且目的蛋白得到穩定正確表達。本結果為進一步研究SV2A在癲癇等神經系統疾病中的功能奠定了實驗基礎。

4 結 論

本實驗利用分子克隆的方法成功構建了重組真核表達質粒p3×Flag-CMV-10-SV2A，通過菌落PCR、酶切和測序檢測了質粒構建的正確性，并在HEK293T細胞中驗證了其表達情況。p3×Flag-CMV-10-SV2A真核表達質粒的構建為今后建立穩定表達SV2A的細胞模型，為進一步研究SV2A的生物學功能及其在神經系統疾病中的作用奠定了實驗基礎。