焦磷酸測序法在幽門螺桿菌克拉霉素耐藥基因檢測及藥物療效評價中的應用*

初亞男，張婕妤，陸 瑤，張晏潔，封利穎

(東部戰區總醫院藥理科，江蘇南京 210002)

幽門螺桿菌(Hp)是一種革蘭陰性桿菌，特異地定植于胃上皮細胞，是人類慢性胃炎、消化性潰瘍、胃癌等疾病的主要誘因，中國有40%～60%的人群感染Hp[1-3]。質子泵抑制劑、克拉霉素和阿莫西林組成的標準三聯療法的治愈率正在逐年下降，造成這種現象的原因是Hp對克拉霉素耐藥[4]，Hp中23S核糖體RNA基因(23S rRNA基因)A2142G和A2143G 2個單核苷酸多態性(SNP)位點的突變是導致耐藥突變的主要原因[5-7]，因此本研究擬采用無需電泳、熒光標記且具有半定量能力的焦磷酸測序方法，通過在Hp特異性的23S rRNA基因的保守區域設計焦磷酸測序引物，得到含耐藥位點的23S rRNA的部分片段，對片段中的2個SNP耐藥位點進行分析得到耐藥信息。實現用藥前的耐藥評價和感染情況分析，為三聯療法的選擇提供依據，同時根據半定量結果實現初步治療效果的評價。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年5-10月本院內鏡中心進行胃鏡檢查且無胃部手術史，未接受三聯或四聯治療的患者為研究對象，共收集了37例患者的鏡檢組織標本，男19例、女18例。37例患者快速尿素酶試驗結果及8例患者的13C尿素呼氣試驗檢測結果由本院消化內科提供。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2儀器與試劑 QIAamp DNA Mini Kit試劑盒和焦磷酸測序試劑盒及退火和結合緩沖液購自德國QIAGEN公司；2×TransTaq?High Fidelity(HiFi) PCR SuperMix Ⅰ試劑盒購自中國北京全式金公司；Takara LA Taq?with GC Buffer購自日本Takara公司；其他試劑均為分析純；實驗用水均為滅菌雙蒸水；Q24焦磷酸測序儀購自德國Qiagen公司；A200基因擴增儀購自中國杭州朗基科學儀器有限公司；微量紫外分光光度計購自中國南京伍義科技有限公司。

1.3方法

1.3.1質粒模板和引物合成 根據NCBI中提供Hp 23S rRNA基因序列，將包含有2142GG型，2143AA型，長度為200 bp的基因片段構建重組質粒，由捷瑞生物合成并構建，作為建立焦磷酸測序反應時條件優化的模板。引物由中國上海Invitrogen公司合成，具體引物名稱及序列見表1。

表1 檢測A2142G和A2143G位點的基因多態性引物

1.3.2黏膜組織獲取及組織中基因組DNA的提取 37名患者于胃竇大彎側取黏膜組織約3 mm×3 mm 2塊，一塊用于快速尿素酶實驗，另一塊放置-80 ℃冰箱低溫保存。按照QIAamp DNA Mini Kit 試劑盒說明操作可同時共提取組織中人和Hp的基因組DNA，采用紫外分光光度計測定標本的水平和純度。所有標本A260/A280均在1.8～2.0之間，水平均大于20 ng/μL，可用于后續測序實驗。

1.3.3克拉霉素耐藥基因檢測的PCR擴增體系的建立 采用Qiagen公司的Assay Design Software2.0設計序列，將2條上游引物分別與下游引物組合，擴增梯度稀釋得到104、103、102copies/μL的23S rRNA基因質粒，每個梯度重復3次，PCR產物電泳后觀察擴增條帶(亮度和單一性)確定最優的引物組合。

由于23S rRNA基因的GC水平較高，因此選擇了2種專門用于擴增高GC水平的2×TransTaq?High Fidelity PCR SuperMix Ⅰ試劑盒(HiFi體系)和TaKaRa LA Taq?with GC Buffe(GC體系)試劑盒。50 μL HiFi體系包括2×TransTaq HiFi Mix Ⅰ 25 μL、上游引物2 μL、下游引物2 μL、模板2.5 μL，加水補充至50 μL。50 μL GC體系包括LA Taq 0.5 μL、2×GC Buffer Ⅰ 25 μL、dNTP 2 μL、上游引物2 μL、下游引物2 μL、模板2.5 μL，加水補充至50 μL。選用上述引物組合分別擴增106、105、104、103、102、101copies/μL的質粒模板，PCR產物電泳后觀察擴增條帶確定最優的擴增體系。

退火溫度是影響PCR擴增的關鍵因素，決定了擴增效率和特異性，因此選擇55、58、59.8、63.4、67、70 ℃ 6個退火溫度梯度，用滅菌雙蒸水作為空白對照，采用HiFi體系進行擴增，PCR產物電泳后觀察擴增條帶確定最優的退火溫度。

1.3.4方法特異性考察 由于從組織中提取到的DNA絕大部分為人基因組DNA，因此需要對引物的特異性進行考察，分別以血液中提取獲得的人基因組DNA和13C確診為Hp感染的人胃竇組織提取的DNA為模板進行擴增，考察本方法的特異性，同時對PCR擴增產物進行Sanger測序，將測序結果與NCBI網站公布的Hp 23S rRNA基因序列進行比對。

1.3.5方法的靈敏度考察 將含有23S rRNA基因的質粒模板梯度稀釋成104、103、102、101copies/μL的模板進行本方法的靈敏度考察，每個水平梯度重復3次，將PCR產物進行電泳和焦磷酸測序。進行焦磷酸測序時，第一個“G”出現信號峰代表突變型信號，“A”出現信號峰代表野生型信號。以焦磷酸測序是否獲得預期的信號峰來評判本方法的靈敏度。

1.3.6方法與Sanger測序的一致性考察 對20例組織標本的PCR擴增產物分別進行焦磷酸測序和外送至華大基因進行Sanger測序，對A2142G和A2143G位點的檢測結果進行分析，評價本方法檢測的一致性。

2 結 果

2.1克拉霉素耐藥基因檢測的PCR擴增體系的條件優化結果 擴增產物的電泳結果表明上游引物2加下游引物的組合擴增條帶更明亮，擴增效率更高，因此優選此引物組合，同理，最佳擴增體系為HiFi體系，最佳溫度為59.8 ℃。

2.2檢測方法的特異性評價 擴增產物的電泳結果表明本方法使用的引物只能特異性地識別含有Hp 23S rRNA 基因組DNA的標本，具備很好的特異性。此外Sanger測序比對的結果表明本方法PCR擴增的產物序列100%同源為Hp 23S rRNA基因序列，因此方法的特異性良好。

2.3靈敏度與基于半定量性能的初步療效評價 采用焦磷酸測序檢測A2142G和A2143G位點的靈敏度為100 copies/μL質粒模板。在考察方法靈敏度時，發現由于焦磷酸測序具備較好的定量效果，不同水平的質粒模板與第一個堿基G的單堿基峰高呈現一定的對應關系，在檢測102copies/μL質粒模板時單堿基峰高為約75 mV，103copies/μL質粒模板時單堿基峰高約為125 mV，104copies/μL質粒模板時單堿基峰高約為250 mV。因此，在檢測過程中以此為參照，對患者治療前和治療后的標本進行檢測就可以初步評估患者的治療效果。見圖1。

圖1 焦磷酸測序用于評估克拉霉素耐藥基因檢測的靈敏度

2.4快速尿素酶試驗與本研究建立方法的檢出率評價 37例患者的胃竇組織標本進行快速尿素酶試驗檢出18例陽性，Hp 感染檢出率為48.7%，焦磷酸測序檢出30例陽性，Hp感染檢出率為81.1%。快速尿素酶檢出的18例陽性標本中除1例外，均與焦測序結果一致。但是由于焦磷酸測序的檢測靈敏度高，可檢出低至100 copies/μL的模板分子，對于Hp水平較低的標本也可以進行有效的檢測，因此對Hp感染的檢出率明顯高于快速尿素酶實驗。此外30例陽性Hp感染的病例中，發現4例克拉霉素耐藥，耐藥率為10.81%(4/37)。

2.513C尿素呼氣試驗與本研究建立方法的檢出率評價13C尿素呼氣試驗被譽為是Hp檢測的金標準，為了對本方法的檢出率進行進一步評價，研究者另外收集了8例患者同時進行13C尿素呼氣試驗和焦磷酸測序實驗。呼氣試驗的Hp感染檢出率為75.0%，本方法的檢出率為87.5%，且陽性標本檢出的一致率為100.0%。

3 討 論

幽門螺桿菌感染和胃癌的形成、發展有著密切的關系[8]，中國也積極開展對Hp感染的防控工作[2]，但是Hp的根除率卻呈現逐漸下降的趨勢[9]，這與Hp的耐藥性逐年升高有關[10-11]?？死顾厥荋p治療三聯療法中最常用的抗菌藥物之一，流行病學數據表明克拉霉素耐藥率也呈現出上升趨勢[12-13]。如能在治療前準確測定Hp的耐藥類型，有針對性的調整抗菌藥物治療方案，采用個體化三聯療法會達到事半功倍的效果。因此Hp治療前耐藥檢測非常重要。傳統的分離培養Hp藥敏試驗方法雖然特異性強，但是會存在培養失敗和耗時長的缺點，無法及時為臨床指導合理用藥提供參考。實時熒光的方法可實現幽門螺桿菌的快速定量檢測與分型鑒定，但對序列存在突變的耐藥片段進行檢測時存在漏檢現象[14-15]。

本研究基于焦磷酸測序技術建立的Hp克拉霉素耐藥基因的檢測方法具備高靈敏、快速、半定量等優點。

4 結 論

本研究建立的方法在測定耐藥情況的同時，擴增Hp特有的23S rRNA基因序列，可用于判定Hp感染情況；通過治療前后測序峰高的數值，可進行Hp感染情況的半定量評價并初步評估治療效果；為Hp的克拉霉素耐藥檢測提供了一種新方案。