流感病毒研究現(xiàn)狀與進(jìn)展

馬 洲， 關(guān) 明， 邢志芳， 曹國(guó)君

（1.復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院北院檢驗(yàn)科，上海 201907；2. 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，上海 200040）

流行性感冒是由流感病毒引發(fā)的急性呼吸道傳染病，春、秋季節(jié)高發(fā)，亞太地區(qū)高發(fā)[1]。

1 流感病毒病原學(xué)

流感病毒是直徑為80～120 nm的球形或絲狀的單股負(fù)鏈分節(jié)段RNA病毒，屬正黏病毒科，其基因組包括8個(gè)獨(dú)立的RNA片段[2]，第1、2、3 片段分別編碼PB1、PB2、PA，參與病毒遺傳物質(zhì)的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄；第4片段編碼血凝素（hemagglutinin，HA），介導(dǎo)受體結(jié)合和膜融合，是流感病毒的主要免疫原性蛋白；第5片段編碼核蛋白（nucleoprotein，NP），NP與病毒組RNA及PB1、PB2、PA相連構(gòu)成核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP），參與病毒的裝配和RNA的合成；第6片段編碼神經(jīng)氨酸酶（neuraminidase，NA），NA可以清除細(xì)胞表面的唾液酸，防止病毒粒子聚集，促進(jìn)病毒的釋放；第7片段編碼基質(zhì)蛋白（matrix protein，MP），MP中的M1能維持病毒的形態(tài)，是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，其與NP是病毒分型的依據(jù)；第8片段編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NEP/NS2，NS1能拮抗宿主的非特異性免疫，并抑制干擾素產(chǎn)生，NEP/NS2可促進(jìn)病毒RNA的表達(dá)，并參與其轉(zhuǎn)運(yùn)過程。

根據(jù)NP和MP的抗原性差異，流感病毒可以分為甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒及丁型流感病毒4類。（1）甲型流感病毒。該病毒宿主眾多、血清型復(fù)雜，能夠通過基因重組和適應(yīng)性突變獲得跨宿主傳播能力。人類對(duì)甲型流感病毒缺乏持久的免疫力，所以所有年齡段人群均普遍易感，甲型流感病毒是引起流行性感冒大流行的最主要病原體[3]。甲型流感病毒表面蛋白HA有16個(gè)亞型，NA有9個(gè)亞型，病毒可根據(jù)HA和NA的組合情況進(jìn)一步分類為若干亞型。由于HA和NA抗原結(jié)構(gòu)能通過基因位點(diǎn)的突變或基因重組使病毒變異，因此甲型流感病毒屬中的禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）能夠突破種屬屏障感染人類，目前能夠感染人類的AIV有：H5N1、H5N6、H6N1、H7N7、H7N9等亞型[4]。AIV曾暴發(fā)式大流行，涉及多個(gè)國(guó)家和地區(qū)，如2009年暴發(fā)的甲型H1N1流感病毒[4]。（2）乙型流感病毒。該病毒多在小范圍內(nèi)流行傳播，目前無亞型之分，引起人類感染的主要是乙型Yamagata系或乙型Victoria系。亞太地區(qū)的15個(gè)國(guó)家在每個(gè)月的流行性感冒確診病例中，乙型流感病毒的確診率為0～92%[1]，與甲型流感病毒不同，兒童、老年人等特定人群易感乙型流感病毒，并易引發(fā)并發(fā)癥，對(duì)社會(huì)造成的負(fù)擔(dān)甚至超過甲型流感病毒[5]。（3）丙型流感病毒。該病毒檢出率較低，通常導(dǎo)致輕度感染，對(duì)公共衛(wèi)生和健康影響較小。（4）丁型流感病毒。該病毒是最近幾年才被發(fā)現(xiàn)的，主要感染牛、羊、豬等[6]。

2 流行性感冒的臨床表現(xiàn)與病毒的傳播途徑

流行性感冒的臨床表現(xiàn)主要為：咳嗽、鼻塞、頭痛、咽喉痛、食欲減退、胸骨后不適、肌肉酸痛等全身性不適。甲型流感病毒感染患者常伴有發(fā)熱，體溫可達(dá)39 ℃，甚至超過39 ℃。感染乙型流感病毒的兒童多表現(xiàn)為嘔吐、腹痛、腹瀉。無并發(fā)癥的流感病毒感染患者多為自限性病程，發(fā)病1周左右高熱逐漸消退，全身癥狀好轉(zhuǎn)。在兒童、孕婦、老年人和免疫缺陷群體等高危人群中，流感病毒可誘發(fā)嚴(yán)重的病毒性肺炎，導(dǎo)致多器官衰竭或基礎(chǔ)疾病惡化。因兒童呼吸道保護(hù)屏障發(fā)育不完善，更易引起咽喉炎、支氣管炎或肺炎等癥狀，有26.5%的季節(jié)性流行性感冒住院患兒可并發(fā)肺炎[7]。老年人由于常伴有呼吸系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等原發(fā)疾病，感染病毒后病情較重且進(jìn)展快，肺炎發(fā)生率高于青壯年人群，且易誘發(fā)心力衰竭、急性心肌梗死或并發(fā)腦炎等疾病，在65歲以上老年人群中，流行性感冒相關(guān)死亡率與年齡呈正相關(guān)[8]。女性在懷孕期間呼吸系統(tǒng)功能明顯改變，且免疫系統(tǒng)會(huì)介導(dǎo)細(xì)胞免疫向體液免疫轉(zhuǎn)移，因此孕婦對(duì)于流感病毒的抵抗力更弱，感染后易發(fā)生肺炎、呼吸困難，甚至有流產(chǎn)、早產(chǎn)、胎死宮內(nèi)等風(fēng)險(xiǎn)[9]。

被流感病毒感染后，患者的呼吸道分泌物中存在大量的流感病毒顆粒，可在打噴嚏和咳嗽時(shí)通過飛沫傳播。此外，流感病毒也可通過口腔、鼻腔、眼睛等黏膜直接或間接接觸傳播[10]。對(duì)人類造成嚴(yán)重影響的AIV的傳播方式主要是通過接觸被感染禽類及其排泄物等，尚未發(fā)現(xiàn)人傳人的現(xiàn)象[11]。由于病毒結(jié)合受體存在差異，甲型流感病毒通過人類呼吸道中的SAα2-6唾液酸受體感染宿主，而AIV感染禽類則是通過結(jié)合禽類胃腸道上的SAα2-3唾液酸受體[12]，因此AIV是否能實(shí)現(xiàn)宿主間的傳播，關(guān)鍵在于其受體結(jié)合能力。

3 流感病毒的致病機(jī)制

流感病毒表面的HA和NA均有助于流感病毒的傳播、增殖，且極易發(fā)生基因重組，增強(qiáng)病毒的致病性。HA能夠識(shí)別宿主細(xì)胞表面的SA受體并與其結(jié)合，通過胞吞作用進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，促進(jìn)M2離子通道的形成，而M2可促進(jìn)病毒粒子進(jìn)入宿主細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)制。同時(shí)，NA有助于新形成的病毒顆粒被釋放，病毒即是以這種方式在細(xì)胞間傳播。HA還含有對(duì)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生中和抗體起關(guān)鍵作用的抗原決定簇，因此HA的表位是影響病毒突變和重組機(jī)制的主要決定因素，其高變異性使病毒能夠逃避宿主的免疫監(jiān)視[13]。HA能夠迅速活化蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），有利于病毒的侵入復(fù)制，并通過PKC—Ot的活化和核蛋白輸出進(jìn)一步激活絲裂原活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）通路，使核輸出更為有效，進(jìn)一步促進(jìn)病毒的復(fù)制。除此之外，非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NEP/NS2的存在為病毒在宿主體內(nèi)復(fù)制定植創(chuàng)造了基礎(chǔ)條件，其中NS1能對(duì)抗宿主天然免疫反應(yīng)，抑制干擾素產(chǎn)生；NEP/NS2則參與拮抗宿主抗病毒反應(yīng)。

在免疫應(yīng)答初期，細(xì)胞因子會(huì)幫助宿主抵抗病毒感染，但長(zhǎng)期的持續(xù)感染會(huì)導(dǎo)致相關(guān)信號(hào)通路被激活，引起多種炎癥因子級(jí)聯(lián)放大，形成細(xì)胞因子風(fēng)暴，從而導(dǎo)致急性肺損傷[14]。病毒的模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR），包括Toll樣受體（Toll like receptor，TLR）、RIG-I樣受體（RIG-I like receptor，RLR）和NOD樣受體（NOD like receptor，NLR）等，是抑制重癥感染誘發(fā)免疫性病理?yè)p傷及研究非特異性免疫應(yīng)答的重要靶點(diǎn)，流感病毒通過操縱這些信號(hào)分子可以有效使被感染宿主致病。TLR是病原體的主要傳感器，TLR3介導(dǎo)病毒dsRNA的識(shí)別，TLR4介導(dǎo)急性肺損傷，高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）識(shí)別TLR4后活化核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）產(chǎn)生干擾素（interferon，IFN），可導(dǎo)致重癥肺炎[15]。TLR7/8介導(dǎo)病毒ssRNA的識(shí)別，激活NF-κB，促進(jìn)多種炎性細(xì)胞因子的分泌[16]。NLR能誘導(dǎo)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，但過度活化會(huì)導(dǎo)致免疫損傷，如NLRP3過度活化可導(dǎo)致非致命性流感病毒感染中的嚴(yán)重肺損傷[17]。除此之外，流感病毒能夠激活p53，抑制干擾素誘導(dǎo)的跨膜蛋白，維持病毒的傳染性，并可促進(jìn)病毒繁殖[18]。

4 流感病毒的檢測(cè)方法

目前，臨床實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)流感病毒的方法主要為病毒分離培養(yǎng)、病毒抗原檢測(cè)、病毒核酸檢測(cè)等。

4.1 病毒分離培養(yǎng)

分離培養(yǎng)是最傳統(tǒng)的病毒檢測(cè)方法。將患者樣本接種于細(xì)胞或胚胎中，繁殖7～10 d，監(jiān)測(cè)細(xì)胞是否發(fā)生病變，然后通過特異性染色或免疫熒光顯微鏡等最終確認(rèn)是否存在流感病毒[19]。離心細(xì)胞培養(yǎng)法（shell viral culture，SVC）是另一種病毒培養(yǎng)方法，與傳統(tǒng)的病毒分離方法相比更簡(jiǎn)單、快捷、靈敏，可在24～48 h檢測(cè)到病毒[20]，特異性高，是病毒感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，也是疫苗研制的基礎(chǔ)，但培養(yǎng)病毒耗時(shí)長(zhǎng)、易發(fā)生支原體污染，難以滿足大量樣本或大量病原體快速檢測(cè)的需求。

4.2 抗原檢測(cè)

常用的抗原檢測(cè)方法有直接免疫熒光法（direct immuno fluorescence，DFA）和流感病毒快速診斷測(cè)試（rapid diagnosis test of influenza，RIDT）。DFA是通過熒光直接標(biāo)記流感病毒的特異性抗體，在熒光顯微鏡下觀察鼻咽拭子的呼吸道上皮細(xì)胞中有無特異性病毒抗原；RIDT是采用免疫層析法，用膠體金或乳膠顆粒標(biāo)記流感病毒抗體，通過抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)，30 min即可判讀結(jié)果[21]。抗原檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)是操作方便、檢測(cè)周期短、效率高，能滿足短時(shí)間內(nèi)檢測(cè)大量樣本的需求；缺點(diǎn)是檢測(cè)敏感性和特異性不夠高，只能區(qū)分甲型和乙型流感病毒，無法區(qū)分病毒的亞型，且抗原抗體易發(fā)生非特異性結(jié)合。

4.3 核酸檢測(cè)

4.3.1 聚合酶鏈反應(yīng) 聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)的快速發(fā)展讓傳染病診斷有了更廣闊的空間，相比抗原檢測(cè)，核酸檢測(cè)更為敏感，能夠在早期檢出臨床樣本中的病毒。目前用于人類流感病毒感染的檢測(cè)方法有：逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）、逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（reverse transcription loop mediated isothermal amplification，RT-LAMP）、基于簡(jiǎn)單擴(kuò)增的檢測(cè)（detection based on simple amplification，SAMBA）、依賴核酸序列的擴(kuò)增（amplification of DNA dependent sequences，NASBA）和微陣列技術(shù)等[20]。其優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)敏感性和特異性好，能夠精確鑒別未知流感病毒株的分型，適用于篩選和鑒定亞型流感病毒。缺點(diǎn)是僅限于對(duì)單一病原體型別進(jìn)行診斷，檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)、操作復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)室和操作人員要求較高，且結(jié)果易受基因突變、抑制劑和RNA降解影響。

4.3.2 基因測(cè)序法 測(cè)序是基因診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，通過測(cè)序技術(shù)可以準(zhǔn)確、快速地獲取生物體的遺傳信息。ZHAO等[22]利用RT-PCR——下一代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）診斷平臺(tái)對(duì)161份臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明該平臺(tái)能夠在核酸低濃度條件下實(shí)現(xiàn)與實(shí)時(shí)RT-PCR相同的高靈敏度，并且能夠提供流感病毒基因組全譜，實(shí)現(xiàn)多重識(shí)別和功能意義的同步鑒定。SEONG等[19]采用NGS深度測(cè)序技術(shù)，檢測(cè)了鼻咽拭子等臨床樣本，結(jié)果表明該方法能有效地應(yīng)用于調(diào)查致病性流行性感冒的分子特征。LEE等[23]在MiSeq測(cè)序器上開發(fā)了一種檢測(cè)試劑盒和軟件，對(duì)148份H3N2甲型流感病毒樣本進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明該方法能有效控制高通量測(cè)序的樣本污染率，并比Sanger測(cè)序更加高效。高通量測(cè)序法的優(yōu)點(diǎn)是檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確度高，可以對(duì)流感病毒進(jìn)行準(zhǔn)確的基因檢測(cè)和分型，即使在發(fā)生基因突變的情況下也能實(shí)現(xiàn)，但檢測(cè)成本較高、周期長(zhǎng)，難以滿足快速檢測(cè)大量樣本的需求，樣本與樣本之間存在交叉污染的可能，易造成假陽(yáng)性。

4.4 其他檢測(cè)方法

流感病毒的檢測(cè)方法多種多樣，芯片技術(shù)是其中之一。芯片技術(shù)起源于微機(jī)電系統(tǒng)，現(xiàn)已被用于多種病原體的檢測(cè)。SHEN等[24]開發(fā)了一種以HA、NA陣列為特征的微流控芯片，通過使用聚糖包被的磁珠和RT-PCR，實(shí)現(xiàn)流感病毒的快速檢測(cè)，并可在100 min內(nèi)完成12種甲型流感病毒亞型的檢測(cè)。LU等[25]建立了一個(gè)磁控?cái)?shù)字化微流控平臺(tái)，利用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測(cè)甲型H1N1病毒抗體，整個(gè)分析過程可在40 min內(nèi)完成，且靈敏度高，在快速診斷流感病毒方面具有很大的潛力。芯片技術(shù)反應(yīng)效率高、檢測(cè)通量高、試劑消耗少，但設(shè)備昂貴，操作比較復(fù)雜，只能檢測(cè)已知的位點(diǎn)，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性結(jié)果。

5 流感病毒感染的治療及預(yù)防

流感病毒表面的NA能促進(jìn)成熟病毒顆粒脫落傳播，而神經(jīng)氨酸酶抑制劑（neuraminidase inhibitors，NAIS）可以與NA特異性結(jié)合，從而抑制病毒的傳播、釋放。奧司他韋能夠?qū)⒛c道中的酯酶轉(zhuǎn)為活性代謝物，從而干擾病毒的傳播，患者入院6 h內(nèi)用藥，有助于縮短住院時(shí)間、改善生存率[26]。但如果患者入院時(shí)已經(jīng)出現(xiàn)了下呼吸道感染癥狀，即使使用奧司他韋，也無法更好地改善癥狀或降低病死率，但雷帕霉素和奧司他韋聯(lián)合使用，對(duì)已發(fā)生嚴(yán)重免疫損傷的患者有一定療效[27]，原因在于藥物可通過抑制ALRP3介導(dǎo)的信號(hào)通路，進(jìn)一步抑制病毒復(fù)制和免疫過度，緩解肺損傷嚴(yán)重程度，降低患者死亡率。帕拉米韋作為唯一的靜脈注射類NAIS，療效要優(yōu)于其他NAIS，且對(duì)兒童和成人均有效，比口服奧司他韋能夠更有效地縮短退燒時(shí)間[28]，但可能會(huì)與其他 NAIS相互耐藥，且對(duì)奧司他韋耐藥的患者療效不理想[29]。有研究發(fā)現(xiàn)，咖啡酸與帕拉米韋聯(lián)合使用能增加藥物對(duì)NA的親和力，是解決耐藥性問題的突破口[30]。雖然長(zhǎng)期使用帕拉米韋會(huì)誘導(dǎo)流感病毒位點(diǎn)的突變，削弱病毒復(fù)制能力，但會(huì)導(dǎo)致患者對(duì)所有的NAIS耐藥，應(yīng)謹(jǐn)慎使用[31]。

隨著對(duì)NAIS耐藥病例的日益增多，具有不同機(jī)制的新型抗病毒藥物被研發(fā)出來，如巴洛沙韋。巴洛沙韋是一種帽依賴性核酸內(nèi)切酶抑制劑，能夠抑制病毒自身mRNA的轉(zhuǎn)錄[32]。有研究結(jié)果顯示其不良反應(yīng)發(fā)生率顯著低于奧司他韋[33]。

每年全球范圍內(nèi)的流行性感冒病例中，有300萬～500萬例嚴(yán)重病例，與呼吸道疾病相關(guān)的死亡病例為29萬～65萬例[34]，接種疫苗仍是目前最有效的防范手段。現(xiàn)有的流感疫苗包括裂解疫苗、減毒活疫苗、全病毒滅活疫苗等。人用流感疫苗通常采用的是雞胚法，但其操作復(fù)雜、生產(chǎn)周期長(zhǎng)，目前科學(xué)家積極研發(fā)了犬腎細(xì)胞（Madin-Darby canine kidney，MDCK）、非洲綠猴腎細(xì)胞（african green monkey kidney cell，Vero）和人胚胎成視網(wǎng)膜細(xì)胞（human embryonic retinoblasts，PER.C6）等基于細(xì)胞培養(yǎng)的技術(shù)，用于流感疫苗的制備[35]。除了接種疫苗，在流行性感冒高發(fā)季節(jié)，建議采取佩戴口罩、勤洗手等防護(hù)措施，同時(shí)增強(qiáng)自身免疫力，注意保暖及空氣的流通。如出現(xiàn)感冒癥狀，應(yīng)注意休息，避免去人群密集場(chǎng)所造成病毒的二次傳播，有發(fā)熱現(xiàn)象應(yīng)及時(shí)就醫(yī)。

6 展望

流感病毒每年均反復(fù)引發(fā)人類呼吸道疾病，給社會(huì)經(jīng)濟(jì)和人類健康造成了沉重的負(fù)擔(dān)[36]。目前預(yù)防和控制流行性感冒最為有效的措施就是接種疫苗。盡管公共衛(wèi)生組織建議6月齡以上的人群都應(yīng)接種流感疫苗，尤其是兒童、老年人、孕婦等易感人群及免疫功能缺陷的群體，然而由于流感疫苗的接種主要基于自愿、自費(fèi)和我國(guó)人口基數(shù)龐大、流感疫苗需每年接種等原因，很大程度上影響了我國(guó)疫苗的接種覆蓋率[37]。我們無法預(yù)測(cè)流行性感冒的發(fā)展趨勢(shì)，是否會(huì)出現(xiàn)新的亞型、是否會(huì)跨物種傳播、是否會(huì)造成新的大流行，所以仍需對(duì)流感病毒進(jìn)行深入研究，積極研發(fā)更有效的疫苗和抗病毒藥物，積極開發(fā)更有效的檢測(cè)手段，盡量避免大流行的出現(xiàn)，確保公眾健康。