2種SARS-CoV-2 抗體檢測方法在COVID-19診斷中的價值

胡 燕， 申 鴿， 李 瓊， 曾紫嫣， 朱 攀， 楊 鋼， 李 萍， 陳煜楓， 張 貞， 謝小兵

（1.湖南中醫藥大學第一附屬醫院醫學檢驗與病理中心，湖南 長沙 410007；2.婁底市疾病預防控制中心，湖南 婁底 417000）

新型冠狀病毒肺炎（corona virus disease 2019，COVID-19）由嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-CoV-2）感染引起，該病毒是之前從未在人體中發現的冠狀病毒新毒株[1-2]。《新型冠狀病毒感染肺炎診療方案（試行第七版）》[3]將COVID-19確診標準在原有核酸檢測和測序的基礎上增加了血清學檢測，即“SARSCoV-2特異性IgM抗體和 IgG抗體陽性”或“SARS-CoV-2特異性IgG抗體由陰性轉為陽性或恢復期較急性期升高4倍及以上”可確診。目前，SARS-CoV-2抗體的檢測方法主要有化學發光法、膠體金法、酶聯免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）等。本研究擬對化學發光法和ELISA檢測血清SARS-CoV-2抗體的性能進行評價，探討其在COVID-19診斷和大規模篩查中的價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2020年1—3月湖南中醫藥大學第一附屬醫院和婁底市疾病預防控制中心COVID-19確診患者116例，其中男60例、女56例，年齡19～81歲。所有患者均符合《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》中的診斷標準。選取湖南中醫藥大學第一附屬醫院健康體檢者90名和非COVID-19住院患者（包括呼吸內科、腫瘤科、結石科、血液病科、血透室、針灸推拿科等）256例作為非COVID-19組，其中男205例、女141例，年齡3～83歲。2個組之間年齡、性別差異均無統計學意義（P＞0.05）。本研究經湖南中醫藥大學第一附屬醫院醫學倫理委員會批準，患者及其家屬均知情同意。

1.2 入選及排除標準

COVID-19患者均有明確的流行病學接觸史及COVID-19臨床癥狀和/或肺部影像學特征，且呼吸道樣本或糞便樣本SARS-CoV-2核酸陽性。非COVID-19 組所有患者呼吸道樣本SARSCoV-2核酸陰性，沒有流行病學接觸史，且均沒有COVID-19臨床癥狀和肺部影像學特征。

1.2 方法

1.2.1 樣本采集 由護士在三級防護下采集COVID-19患者確診后1～7 d內的空腹靜脈血5 mL，嚴格按標準操作流程密封轉運至湖南中醫藥大學第一附屬醫院檢驗科。由護士采用真空采血管采集所有非COVID-19患者空腹靜脈血5 mL，密封轉運至湖南中醫藥大學第一附屬醫院檢驗科。所有樣本均經1 200×g離心5 min，分離血清。

1.2.2 化學發光法檢測血清SARS-CoV-2抗體 采用iFlash3000全自動化學發光免疫分析儀（深圳市亞輝龍生物科技股份有限公司）及配套試劑（化學發光法）檢測SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體。基本原理：采用基于直接化學發光技術的兩步間接免疫法。樣本中的SARS-CoV-2 IgM或IgG抗體與樣本處理液中包被SARS-CoV-2抗原的磁珠結合，形成抗原-抗體復合物，然后用清洗液洗去未結合的物質，再加入吖啶酯標記的鼠抗人IgM抗體，形成抗原-抗體-二抗復合物，清洗后加入預激發液和激發液，測定相對發光強度（relative light unit，RLU）。樣本中的SARS-CoV-2 IgM或IgG抗體水平與RLU呈正相關。儀器根據RLU及內置校準曲線自動計算出IgM或IgG抗體水平，以≥10.0 AU/mL為陽性。

1.2.3 ELISA檢測血清SARS-CoV-2抗體 SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體ELISA試劑盒購自珠海麗珠試劑股份有限公司。檢測儀器為ECAN200-8全自動酶免分析儀（瑞士帝肯公司）。基本原理：SARS-CoV-2 IgM 抗體采用捕獲法檢測。以抗人IgM μ鏈（包被二抗）包被微孔板，加入樣本，如樣本中存在IgM抗體，則會形成抗體-包被二抗復合物，洗滌后加入酶標記的重組SARS-CoV-2抗原（酶標抗原），形成酶標抗原-待測抗體-包被二抗復合物，洗滌后加入底物緩沖液和底物液，顯色并終止反應。SARSCoV-2 IgG抗體采用間接法檢測。以重組SARSCoV-2抗原（包被抗原）包被微孔板，加入樣本，如樣本中存在IgG抗體（待測抗體），則會形成待測抗體-包被抗原復合物。洗滌加入酶標記的抗人IgG抗體（酶標二抗），形成酶標二抗-待測抗體-包被抗原復合物。洗滌后加入底物緩沖液和底物液，顯色并終止反應。SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體均以樣本吸光度（A）值≥Cut-off值為陽性。

1.3 統計學方法

采用GraphPad Prism 5軟件進行統計分析。計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 化學發光法和ELISA檢測血清SARS-CoV-2 IgG抗體性能比較

在116例COVID-19患者中，化學發光法檢出105例，敏感性為90.52%；ELISA檢出74例，敏感性為63.79%。在346例非COVID-19者中，化學發光法檢出342例，特異性為98.84%；ELISA檢出334例，特異性為96.53%。化學發光法和ELISA的陽性預測值分別為96.33%、86.05%，陰性預測值分別為96.66%、88.83%，準確性分別為96.75%、88.31%。化學發光法檢測SARS-CoV-2 IgG抗體的敏感性、陽性預測值、陰性預測值及準確性優于ELISA（P＜0.05），而特異性2種方法之間差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.2 化學發光法和ELISA檢測血清 SARS-CoV-2 IgM抗體性能比較

在116例COVID-19患者中，化學發光法檢出88例，敏感性為75.86%；ELISA檢出68例，敏感性為58.62%。在346例非COVID-19者中，化學發光法檢出344例，特異性為99.42%；ELISA檢出337例，特異性為97.40%。化學發光法和ELISA的陽性預測值分別為97.78%、88.31%，陰性預測值分別為92.47%、87.53%，準確性分別為96.86%、87.66%。化學發光法檢測SARSCoV-2 IgM抗體的敏感性、陽性預測值、陰性預測值及準確性優于ELISA（P＜0.05），而特異性2種方法之間差異無統計學意義（P＞0.05）。

2.3 2種方法SARS-CoV-2 IgG和IgM抗體聯合檢測陽性率的比較

在116例COVID-19患者中，化學發光法和ELISA SARS-CoV-2 IgG抗體和IgM抗體聯合檢測的陽性率分別為100%（116/116）和68.97%（80/116）。在346例非COVID-19者中，化學發光法和ELISA 2種抗體聯合檢測的陽性率分別為1.16%（4/346）和 4.91%（17/346）。化學發光法2種抗體聯合檢測的敏感性優于ELISA（P＜0.05）。

3 討論

自COVID-19疫情發生以來，SARS-CoV-2核酸陽性或基因測序結果與已知的SARS-CoV-2高度同源一直是COVID-19疑似病例的確診標準。但SARS-CoV-2核酸檢測易出現假陰性情況，導致核酸檢測結果與患者臨床癥狀、影像學檢查結果不符，這給COVID-19的診斷及防控帶來巨大的不便[4-5]。因此，《新型冠狀病毒感染肺炎診療方案（試行第七版）》[3]將血清學抗體檢測納入COVID-19的確診標準中。

目前，我國已有商品化SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體檢測的試劑盒。由于 COVID-19為新發的傳染病，抗體檢測對于SARS-CoV-2感染的診斷來說是一個全新的方法，因此有必要對不同抗體檢測方法的敏感性和特異性進行驗證。有研究結果顯示，采用化學發光法檢測SARSCoV-2 IgM和IgG抗體有較高的敏感性和特異性[6]。然而，ELISA檢測SARS-CoV-2 IgM和IgG抗體目前臨床報道較少。本研究結果顯示，化學發光法檢測SARS-CoV-2 IgG和IgM抗體的敏感性分別為90.52%和75.86%，與文獻報道[6-7]有一定的差異，可能與不同試劑的檢測原理不同有關。ELISA檢測SARS-CoV-2 IgG和IgM抗體的敏感性分別為63.79%和58.62%。2種抗體聯合檢測時，化學發光法的敏感性為100%，ELISA為68.97%。這提示2種抗體聯合檢測可顯著提高檢測效能。

針對同一抗體的不同檢測方法（間接法、捕獲法等）會因檢測原理的不同而導致敏感性、特異性出現差異，本研究使用的化學發光法試劑盒的檢測原理是基于直接化學發光技術的兩步間接免疫法，針對的是SARS-CoV-2的核衣殼蛋白和刺突蛋白，采用免疫磁捕獲技術對血清中的SARS-CoV-2抗體進行特異性捕獲，由于磁性納米顆粒具有大比表面積、較好的分離富集能力、易于操控等特點，能夠快速富集、分離血清中的抗體，因而敏感性較高。本研究使用的ELISA試劑盒敏感性相對較低和出現假陰性的原因可能與重組抗原的制備、包被及酶標記重組抗原影響了抗原與抗體的結合力有關。目前，商品化的ELISA試劑往往需要借助酶的催化放大作用，通過結合在免疫復合物上的酶催化底物水解，使底物顏色發生改變來實現信號的輸出，如果能夠提高酶的催化水解效果，則可大大提高ELISA的檢測靈敏度[8]。

目前，隨著我國疫情形勢的好轉，SARSCoV-2無癥狀感染者受到越來越多的關注。由于無癥狀感染者無任何明顯的癥狀與體征，在人群中難以被發現，其導致的疫情傳播也難以預防。為此，要做好無癥狀感染者的監測，必須有針對性地加大篩查力度。實時熒光定量聚合酶鏈反應操作繁瑣，檢測耗時較長，對人員及實驗場地等的要求較高，因此基層醫院難以開展。本研究結果顯示，化學發光法檢測SARS-CoV-2 IgG抗體和IgM抗體的準確性分別為96.75%和96.86%，ELISA分別為88.31%和87.66%。雖然ELISA的準確性低于化學發光法，但2種方法的特異性均較高，化學發光法與ELISA檢測IgG抗體的特異性分別為98.84%和96.53%，檢測IgM抗體的特異性分別為99.42%和97.40%。2種方法的特異性差異無統計學意義（P＞0.05）。這表明采用化學發光法與ELISA檢測血清SARS-CoV-2抗體可實現SARS-CoV-2感染的快速篩查與鑒別，尤其是在大規模復工復產人群的篩查中，ELISA成本低，可手工操作，不受儀器、場地限制，可作為SARS-CoV-2感染的篩查方法。

本研究結果還顯示，在非COVID-19組中，化學發光法檢出4例IgG抗體陽性、2例IgM抗體陽性。查看患者血清樣本性狀，有2例脂血嚴重、1例溶血，還有1例原因未明，可能與患者自身或試劑等因素有關；ELISA檢出2例IgM抗體與IgG抗體聯合檢測陽性，此2例患者1例78歲、1例73歲，均患有自身免疫性疾病，類風濕因子均有不同程度的升高，因而造成檢測結果的假陽性。另外，ELISA檢測結果中還有6例弱陽性（A值稍高于Cut-off值），隔天重新采樣復查后，結果均為陰性。

綜上所述，化學發光法和ELISA檢測血清SARS-CoV-2 IgG抗體和IgM抗體的敏感性、特異性、準確性均較高，可作為COVID-19的輔助診斷方法。另外，化學發光法適用于疑似患者的輔助診斷，而ELISA更適用于大規模人群的篩查，臨床實驗室可根據實際情況選擇合適的方法。