人源腫瘤異種移植模型在上皮性卵巢癌研究中的應用進展

楊 雯，孟元光

解放軍總醫院第一醫學中心 婦產科，北京 100853

上皮性卵巢癌(epithelial ovarian cancer，EOC)是卵巢癌中最常見的類型，包括有相似臨床特征和行為的上皮性卵巢癌、輸卵管癌及原發性腹膜癌。EOC的標準治療方案為腫瘤細胞減滅術后采用以鉑類藥物為基礎的一線方案輔助化療[1]。隨著研究的進展，EOC患者的生存狀況得到了一定的改善，但是總體臨床治療效果并不理想，5年生存率僅有30% ～ 46%。EOC治療難點在于患者對鉑類藥物化療耐藥[2-3]。為了解決這一問題，許多研究人員開始嘗試采用人源腫瘤異種移植(patientderived xenograft，PDX)模型進行相關藥效學及腫瘤發生及轉移機制的研究[4-6]。

1 PDX模型概述

PDX模型是以患者手術切除或活檢的新鮮腫瘤組織，植入5 ～ 8周齡免疫缺陷小鼠體內，使腫瘤在動物體內生長，進而進行相關體內實驗的動物模型[5]。最早的PDX模型為1969年建立的結腸腫瘤人源腫瘤異種移植模型。在PDX模型建立前，腫瘤藥物的研究采用細胞系腫瘤異種移植(cell line-derived xenograft，CDX)模型。CDX模型是將人體腫瘤細胞系移植入動物體內建立的，CDX模型的優點為建立容易、重復性好、細胞體外長期傳代、呈現高度同源性。但CDX模型也存在一定缺陷，相對于建系的瘤株，人體原發腫瘤的所有細胞亞群并不能全部出現在移植瘤中，且腫瘤組織的間質中存在免疫缺陷動物的成分。因此CDX模型的生物學特性與真正人類腫瘤的特性存在較大差異[6]。而PDX模型采用整塊的新鮮組織，能夠保留腫瘤組織的異質性，保留人源性的基質細胞、血管組織及細胞因子，維持腫瘤組織的微環境不變，且研究表明PDX模型與腫瘤基因組圖譜文庫中患者的基因表達亦呈現較高的一致性[7]。因此PDX模型是上皮性卵巢癌藥物篩選、生物標志物鑒定、臨床前藥物評價和生物學機制研究比較理想的模型[8-9]。

2 上皮性卵巢癌PDX模型(EOC PDX)的建立

自1993年Fu和Hoffman[10]成功建立了首個卵巢癌PDX模型以來，目前已有數個關于卵巢癌PDX模型特征及應用的研究[11]。各個研究中建模的方法存在一定差異。在不同的研究中采用的免疫缺陷小鼠基本有以下幾種：1)裸小鼠(Nude)，由于先天性無胸腺，因此缺乏的免疫細胞為T細胞；2)重度聯合免疫缺陷小鼠(SCID)，T細胞及B細胞缺陷；3)基因敲除小鼠如NSG、NCG、NOG小鼠等，這類是免疫缺陷程度最高的工具小鼠，此類小鼠缺乏T細胞、B細胞及NK細胞，且有溶血補體缺陷、巨噬細胞缺陷和樹突狀細胞缺陷。

目前報道的卵巢癌PDX建模方法有卵巢原位移植、腹腔種植、皮下移植及腎包膜下移植等。由于不同移植位置受到激素影響不同，在卵巢及腹腔移植的腫瘤表型與非原位移植(皮下/腎包膜下)存在一定差異。2014年Ricci等[12]采用NCrnu/nu小鼠和138例患者腫瘤標本成功建立了34例EOC PDX模型，其中22例皮下移植，12例采用腹水腫瘤細胞進行腹腔移植，其中1例患者樣本同時進行了卵巢原位移植。結果發現皮下和腹腔內移植的模型在生長率上表現出顯著差異(分別為1 ～ 15個月和1 ～ 4個月)。同時發現卵巢原位移植的PDX模型與腹水腹腔種植模型的腫瘤腹腔播散程度類似，而且用腫瘤腹水細胞建立的模型會產生腹水，但用實體瘤建立的模型并不產生腹水。2017年Heo等[13]應用BALB/C-nude 小鼠采用腎包膜下植入的方法建立EOC PDX模型，建模成功率48.8%(22/45)。該研究認為腎包膜下建模也是一種可行的方法。首次Fu和Hoffman[10]報道的EOC PDX模型的建模成功率為40%左右，目前建模成功率較高的為2014年Topp等[14]報道的應用NSG小鼠建立的EOC PDX模型，成功率為83%(10/12)。為了保證建模成功，該研究同時采用了皮下及卵巢原位注射兩種方法。影響建模成功率最主要的因素為腫瘤類型而并非移植部位，高級別漿液性癌的成功率高于黏液性癌。皮下移植的優點是腫瘤表型穩定，且體表腫瘤大小易于觀察，測量更準確[15]。

3 PDX模型組織病理學特點與原發腫瘤一致

在組織學方面，幾乎所有的PDX相關研究均證實PDX模型的組織病理學特征與原發腫瘤基本保持一致[12-13,16-20]。Colombo等[17]采用77例卵巢癌患者的新鮮腫瘤組織移植到裸鼠皮下建立PDX模型，35例造模成功。結果顯示，原發腫瘤不同級別的漿液性癌、黏液性癌及透明細胞癌、癌肉瘤(苗勒氏管混合瘤)都在PDX模型中得到表現。尤其是癌肉瘤的模型，忠實地復制了原代腫瘤特征。一般情況下，癌肉瘤在復發和轉移時往往肉瘤會占據癌的成分，但在PDX模型上，癌和肉瘤兩種成分都得到了體現。Liu等[18]建立了14例EOC PDX，發現所有PDX模型的免疫組化均顯示CK陽性，這證實了模型的上皮性起源。此外，大多數模型的腫瘤組織中PA8和WT1的表達與上皮性卵巢癌一致。其中一個有代表性的模型，多個特征性免疫組化結果與原發腫瘤均一致，包括PAX8、P53、CK7和Ki-67，這表明模型與原始患者樣本保持了組織學上的一致性。

4 EOC PDX模型分子特征

已有研究證實PDX模型與腫瘤基因組圖譜文庫中的多種實體瘤的基因特征表達有較高的一致性，其中包括上皮性卵巢癌[7]。Ricci等[12]采用基因芯片的方法，得出二者有73%(18/23)一致性，模型與患者的MET、MY、PI3Kα、PTEN、FGFR1、ERBB2、NF1和RB1基因分布情況類似。Liu等[18]對14例PDX模型通過微陣列比較基因組雜交、目標全外顯子測序分析后，發現模型在特定基因的改變和激活PI3K信號轉導通路上都表現出遺傳多樣性。Li等[19]成功建立了3個化療耐藥和4個化療敏感的卵巢高級別漿液性癌的PDX腫瘤模型。對PDX的RNA序列分析顯示，化療耐藥組與化療敏感組相比，146個基因表達明顯上調，54個基因表達下調。全外顯子測序分析顯示，39個突變位點僅出現在化療耐藥組。SAP25、HLA-DPA1、AKT3和PIK3R5基因的差異表達以及TMEM205和Polr2A的突變可能與卵巢癌化療耐藥有關。HLADPA1高表達患者對初始化療的耐藥性更強。可以發現，PDX模型在腫瘤的耐藥機制方面有較大的研究價值。

5 PDX模型在卵巢癌藥物治療方面的應用

模型的藥效學結果與臨床患者對藥物的反應具有較高的一致性。Topp等[14]采用NSG小鼠和12例卵巢癌患者的標本成功建立10例模型，成功率83%。隨后其采用順鉑單藥化療(順鉑4 mg/kg第1、8、18天給藥)。模型中4例鉑敏感，3例難治，3例鉑耐藥，藥物試驗結果與患者情況基本一致。在卵巢癌靶向治療方面，George等[20]建立了針對BRCA突變的卵巢癌PDX模型，發現具有高p-CHK1表達的BRCA2突變PDX模型對PARP、CHK1和ATR抑制劑的反應表現出與原發腫瘤相似的生長延遲。Ricci等[21]建立3例復發性鉑耐藥型EOC PDX模型，采用的治療藥物為紫杉醇(PTX)、貝伐珠單抗(BEV)及絲裂原活化的細胞外信號調節激酶抑制劑(MEK)。試驗中將這三種藥物兩兩組合或三藥聯用，結果顯示三聯效果優于二聯，在二聯用藥中PTX/BEV＞BEV/MEK＞PTX/MEK。梅奧診所的Harris等[22]利用全基因組配對二代測序(MPseq)方案，鑒定了幾種對于ERBB2通路上編碼基因突變的高級別漿液性卵巢癌，發現化療及抗HER-2的靶向治療的聯合治療方法能顯著縮小PDX腫瘤。Heo等[13]同樣發現EGFR抑制劑厄洛替尼對于透明細胞癌可能有效。Kreitzburg等[23]利用EOC PDX模型發現一種鞘氨醇類似物FTY720可以增加卡鉑及他莫昔芬的抗腫瘤活性。

6 PDX模型在預測患者生存預后中的作用

Eoh等[24]研究發現，建模成功者往往較建模失敗者無進展生存期更短，胚系突變更多。同時未經過新輔助化療直接手術的患者中，建模失敗的患者預后更好。Heo等[13]同樣發現建模成功者總生存期更差。因此認為PDX模型可以作為預測預后的工具之一。

7 PDX模型存在的問題

雖然PDX模型用于卵巢癌的研究存在較多優勢，但其同時存在一定的問題。1)建模費用高、時間長[25]。建模采用的免疫缺陷小鼠目前市場價格在0.6萬/只左右，而藥效學檢測通常需經小鼠傳代后在P2 ～ P3代模型完成，組織塊皮下移植的方法建立的PDX模型生長緩慢。這就造成建模成功到藥效學結束時間為4 ～ 6個月。建模成功后臨床患者往往已經完成3 ～ 6個療程化療，模型的藥效學結果無法及時應用于臨床個體，因此大部分PDX模型用于臨床前科研。Zhan等[26]及Zhang等[27]分別報道采用改良的PDX模型(mini PDX)藥敏試驗所篩選出的化療方案能顯著延長多種惡性腫瘤患者生存期，中位總生存期從13.9個月提高到18.6個月，無疾病進展期從12個月提高到17.6個月，且改良PDX周期短，僅7 d即可完成藥敏試驗，為PDX模型應用于臨床提供了新的思路。但mini PDX模型技術剛出現，還未得到廣泛認可。除此以外，目前還有一些快速的體外腫瘤細胞模型在科研中以及臨床前應用，如類器官模型和三維腫瘤細胞模型[28-29]，但類器官的培養技術及體外模型與臨床一致性還有待提高。2)PDX模型小鼠缺乏免疫系統。研究表明普通PDX模型的mRNA雖然能表現出高級別漿液性卵巢癌的所有分子亞型，但無法表現出其免疫反應亞組[30]，在藥物免疫治療及腫瘤發生免疫相關機制研究方面具有局限性。目前有新的技術將人的造血干細胞(hematopoietic stem cells，HSCs)移植于X線照射的重度免疫缺陷小鼠，然后再將患者的瘤組織移植于該小鼠建立人源化腫瘤模型，可以給腫瘤提供與人體更相似的生長環境[31]。同時，腫瘤基質包含了人的免疫細胞及細胞因子等成分，在腫瘤靶向治療與腫瘤發生、發展、轉移機制研究方面具有重要的應用價值，尤其在研究腫瘤免疫治療方面，是更理想的腫瘤模型。然而，目前從腫瘤患者中分離出HSCs存在一定困難：一方面，在虛弱的人群中進行骨髓活檢很困難；另一方面，生長因子刺激的HSCs骨髓動員至外周血可能會促進腫瘤進展。同時人源化腫瘤模型造價昂貴，推廣存在困難。

8 結語

EOC PDX模型是評價上皮性卵巢癌藥物療效的良好臨床前平臺，其與患者的原代腫瘤在組織病理學、分子特征及藥效反應等方面均保持良好的一致性，有助于解決卵巢癌耐藥等臨床問題，深化其應用有可能使臨床治療獲得更高的成功率。但建立完美的PDX模型還面臨著很長的道路，需要我們不斷的探索。