FQ-PCR對一期、二期梅毒診斷價值的初步探討＊

陶小華，王潤貴，何美華

（江西省皮膚病專科醫(yī)院，南昌 330000）

梅毒是由梅毒螺旋體(Treponema pallidum，TP)引起的一種危害人類健康的性傳播疾病，目前我國梅毒發(fā)病率仍在增加，梅毒在江西省也被列為重點防治的傳染病，為有效防治梅毒傳播，應(yīng)盡可能早期發(fā)現(xiàn)更多的感染者[1，2]。梅毒血清學(xué)檢查因敏感性和特異性均很高仍是梅毒診斷的優(yōu)先方法，但該試驗在窗口期可出現(xiàn)假陰性結(jié)果[3]。為尋找一種相對客觀、陽性率高的檢查方法來彌補梅毒血清學(xué)檢查的不足，本研究初步探討熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（FQ-PCR）對一期、二期梅毒的診斷價值。

1 資料與方法

1.1 病例來源 從2016年12月-2018年10月之間，納入臨床懷疑為早期梅毒（如生殖器潰瘍或皮膚、黏膜有可疑梅毒疹）的皮膚性病門診患者，所有納入患者均簽訂知情同意書。按照《中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準-梅毒診斷標準》，本研究梅毒確診病例滿足以下3項標準：⑴有流行病學(xué)史；⑵臨床表現(xiàn)；⑶非TP血清學(xué)試驗和TP血清學(xué)試驗均陽性。如TPPA、RPR結(jié)果不一致時，通過FTAABS試驗來進一步驗證。為排除前帶現(xiàn)象，當TPPA陽性而RPR陰性時，均將此血清稀釋后再做血清學(xué)試驗。鑒于梅毒感染不足4周時TPPA可為陰性、不足6周時RPR可為陰性，本研究對所有病例在入組時以及隨訪2個月后分別予梅毒血清學(xué)檢查以觀察陽轉(zhuǎn)情況。此外，對所有患者進行HIV、HSV-2檢查等常規(guī)性病檢查。梅毒確診患者同時給予正規(guī)治療。

1.2 樣本采集 ⑴患者在被判斷為疑似病例后，于次日清晨抽取5ml靜脈血送至性病實驗室進行RPR、TPPA、FTA-ABS試驗。⑵FQ-PCR標本采集：滲出性潰瘍采用無菌生理鹽水將皮疹處沖洗干凈后，用拭子將組織液擠出并采集；非滲出性皮膚黏膜損害取材用鈍刀輕輕地刮數(shù)次 （避免出血），取組織滲液。標本采集后均置于無菌試管中，送至檢查。

1.3 試劑 ⑴RPR、TPPA、FTA-ABS試驗試劑盒購于上海榮盛生物公司。⑵FQ-PCR基因擴增選擇已公布的TP-polA保守序列，達安基因股份有限公司設(shè)計一對引物，引物序列和探針序列及標記如下：上游引物 P1：5’-GGTCCTITGTCTITCGTA-3’；下游引物 P2：5’-CTACTTGCGATTGACCTGG-3’；熒 光 探 針 ：5’-(FAM)-ACACGCTCCTAACGTCCDAB-(MGB)-3’

擴增條件：預(yù)變性 93℃，2min；變性 93℃，45s；退火 55℃，60s；延伸 72℃，60s，共 40個循環(huán)。 標準品稀釋、結(jié)果判定嚴格按試劑盒說明書進行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 Excel軟件建立數(shù)據(jù)庫，SPSS16.0軟件統(tǒng)計分析，用描述性統(tǒng)計指標（%）統(tǒng)計各類樣本的FQ-PCR陽性率，χ2檢驗統(tǒng)計不同臨床樣本FQ-PCR陽性率，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本信息 共納入134例具有皮疹被懷疑為早期梅毒患者，收集134份標本用于FQ-PCR檢查，其中一期梅毒可疑（表現(xiàn)為潰瘍）60例，二期梅毒可疑（表現(xiàn)為斑疹、丘疹或結(jié)節(jié)）74例。入組時RPR、TPPA均陽性58例，其中一期梅毒36例，二期梅毒22例。6例TPPA單陽性，經(jīng)稀釋血清均已排除前帶現(xiàn)象。2個月后復(fù)檢RPR、TPPA均陽性67例，較入組時增加9例，其中5例入組時RPR、TPPA均陰性，4例入組時RPR陰性、TPPA陽性，結(jié)合流行病學(xué)史、臨床表現(xiàn)，共診斷一期梅毒41例、二期梅毒26例。入組時FQ-PCR陽性但RPR陰性11例，其中5例患者TPPA陰性、隨訪2個月RPR、TPPA均轉(zhuǎn)為陽性；另外6例RPR陰性、TPPA陽性且經(jīng)FTA-ABS試驗驗證全部陽性，4例HIV陽性、隨訪2個月RPR轉(zhuǎn)為陽性，另外2例HIV陰性、隨訪2個月RPR仍陰性。這9例確診梅毒中一期梅毒5例、二期梅毒4例。FQ-PCR陰性但RPR、TPPA均陽性12例，其中一期梅毒7例、二期梅毒5例。67例非梅毒中46.27%（31/67）被診斷出其他性病，其中19.35%（6/31）為生殖器皰疹。

2.2 FQ-PCR敏感性 一期梅毒FQ-PCR敏感性為95.12%（39/41），二期梅毒FQ-PCR敏感性為61.54%（16/26），兩組敏感性有顯著性差異 （P＜0.05）。7例梅毒中4例HIV陽性，F(xiàn)Q-PCR陽性4例，敏感性為100%，63例HIV陰性梅毒中FQPCR陽性51例，敏感性為80.95%（51/63），兩組敏感性無顯著性差異（P＞0.05）。

2.3 FQ-PCR特異性 FQ-PCR在67例非梅毒患者中2例陽性，特異性為97.01%（65/67）。

3 討論

梅毒患者在感染早期，由于機體未能及時產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，或抗體量少，導(dǎo)致前期梅毒血清學(xué)檢查結(jié)果往往呈陰性。一般感染梅毒后未治療可在4周、6周之前特異性TP試驗、非特異性TP試驗出現(xiàn)假陰性，有報道一期梅毒梅毒血清學(xué)檢查敏感性為86%左右[4]。本研究對入組時懷疑一期、二期梅毒患者分別在入組時、2個月后分別兩次開展梅毒血清學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)梅毒血清學(xué)檢查轉(zhuǎn)陽9例，按照梅毒確診的國家標準，梅毒血清學(xué)檢查按入組時對一期梅毒的敏感性僅為78.05%。因此，一期梅毒需要尋找較梅毒血清學(xué)檢查更為敏感的診斷方法。

梅毒傳統(tǒng)診斷方法包括病原學(xué)檢查和血清學(xué)檢查。病原學(xué)檢查有暗視野顯微鏡檢查、鍍銀染色法、兔感染試驗等，是臨床上診斷梅毒的金標準。隨著病程延長，機體免疫應(yīng)答增強，導(dǎo)致梅毒螺旋體（Treponema pallidum，TP）數(shù)量減少或活力受限，造成暗視野鏡檢陽性率低。TP在鍍銀染色后呈深褐色，敏感性雖高于暗視野檢查，但仍低于梅毒血清學(xué)檢查[5]。兔感染試驗（RIT）是取被檢查病人的血清注射進兔子體內(nèi)，可檢查有否活的TP存在，但該方法費時且敏感性低，常規(guī)開展不切實際[6]。

隨著TP-Nichols株和SS14株基因全序列的測定，為設(shè)計出更多的高特異性的PCR靶序列提供了依據(jù)。本研究采用的FQ-PCR融合了PCR的高靈敏性、核酸分子雜交的高特異性和光譜技術(shù)的高精確定量等優(yōu)點，利用熒光信號的出現(xiàn)及其積累強度對PCR全進程進行實時測定，利用光信號值對未知模板進行定量分析，具有穩(wěn)定性好、特異性強、靈敏度高等特點。本研究發(fā)現(xiàn)，與梅毒血清學(xué)檢查比較，F(xiàn)Q-PCR診斷敏感性一期梅毒較高、二期梅毒敏感性較低，但兩種檢查診斷一期、二期梅毒的特異性無差異。理論上PCR方法可在各期梅毒樣本中檢查到TP-DNA，但其敏感性和特異性受多種因素影響：⑴靶基因。本研究選擇檢測TP已公布的特異性鑒別基因TP0105（polA）保守序列：GenBank TPU57757。PolA是一個編碼多聚酶、廣泛分布于生物體的保守基因，TP-polA與其他生物PolA無同源性，針對TP-polA建立的PCR法具有較好的特異性及敏感性，是一種相對客觀的檢查方法[7]。 ⑵梅毒分期。一期梅毒患者分泌物PCR檢查敏感率明顯高于梅毒血清學(xué)檢查，隨著病程延長，機體免疫反應(yīng)逐漸變強，PCR的檢查效能有所降低，PCR方法對二期梅毒敏感性和特異性均不如梅毒血清學(xué)檢查[3]。⑶標本類型。當TP-PCR檢查某些標本，如血、尿液、腦脊液，可能因其中存在PCR抑制因子而影響檢查結(jié)果[7]。⑷PCR類型。例如巢式PCR利用兩對引物進行兩輪擴增，增加了檢測的敏感性和特異性[8]。⑸合并其他感染。HIV感染可改變梅毒血清學(xué)檢查結(jié)果[9]，本研究納入梅毒合并HIV感染僅有4例，PCR診斷敏感性、特異性卻未見顯著影響。

綜上，我們認為，當懷疑一期梅毒而梅毒血清學(xué)檢查陰性時，F(xiàn)Q-PCR或可作為一個替代診斷方法使用。當然本研究也存在不足：⑴納入樣本量較少，且病例來自某專科三甲皮膚病醫(yī)院性病科，存在選擇性偏倚。⑵梅毒血清學(xué)檢查兩次間隔時間短，僅有2個月，而部分病例RPR、TPPA轉(zhuǎn)陽時間可能會更長。⑶對可能會對FQ-PCR、梅毒血清學(xué)檢查結(jié)果造成影響的因素未嚴格一一排除，如使用免疫調(diào)節(jié)劑等[10]。下一步我們將針對上述問題開展后續(xù)研究。