碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌的檢測方法

周宏偉， 胡燕燕， 張 嶸

（浙江大學醫學院附屬第二醫院檢驗科，浙江 杭州 310009 ）

隨著碳青霉烯類抗菌藥物在臨床的廣泛應用，細菌耐藥形勢日趨嚴峻。本文著重闡述目前國內外關于碳青霉烯類耐藥腸桿菌科細菌（carbapenem-resistantEnterobacteriaceae，CRE）的檢測方法，以期為臨床CRE感染相關疾病的診治提供參考。

1 CRE的國內外流行情況及耐藥機制

碳青霉烯類抗菌藥物是目前臨床上治療多重耐藥腸桿菌科細菌引起的感染的最有效的藥物。但隨著廣譜抗菌藥物在臨床的廣泛使用，多重耐藥和泛耐藥菌株日益增多，尤其是近幾年，CRE的快速播散給臨床抗感染治療帶來了極大的挑戰，已成為嚴重的公共衛生問題[1]。中國CHINET細菌耐藥性監測數據表明，2005年碳青霉烯類抗菌藥物對腸桿菌科細菌保持著較高的抗菌活性，耐藥率低于2%；到2010年，耐藥率明顯上升，達到5%；肺炎克雷伯菌的耐藥率已高達10%[2]。腸桿菌科細菌對碳青霉烯酶類抗菌藥物最常見的耐藥機制為產碳青霉烯酶，其次是高產頭孢菌素酶（ampicillin，AmpC）或超廣譜β-內酰胺酶（extended-spectrum β-lactamase，ESBL）合并膜孔蛋白改變，主動外排系統過度表達和藥物作用靶位改變引起的碳青霉烯類耐藥較為少見[3]。目前報道的一些CRE檢測方法主要也是針對是否產碳青霉烯酶。

2 CRE的實驗室檢測方法

2.1 表型篩選

2.1.1 紙片擴散法初篩試驗 紙片擴散法是最簡易的篩選方法，然而對于不同碳青霉烯類抗菌藥物、不同菌種及不同的耐藥機制，紙片擴散法所用的篩選抗菌藥物亦不同，如篩查產KPC型碳青霉烯酶最好的抗菌藥物為美羅培南[4]，而篩查產碳青霉烯酶菌株最敏感的抗菌藥物為厄他培南[5]。產碳青霉烯酶腸桿菌科細菌通常對三代頭孢菌素耐藥，但產SME或IMI型碳青霉烯酶的腸桿菌科細菌對三代頭孢菌素敏感[6-7]，對摩根摩根菌、變形桿菌屬、普羅威登菌屬的碳青霉烯類抗菌藥物耐藥篩查則需要檢測除亞胺培南外的其他碳青霉烯類抗菌藥物（如美羅培南或厄他培南）。

2.1.2 改良Hodge試驗 2015年，美國臨床實驗室標準化協會（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）推薦采用改良Hodge試驗進行CRE篩查[8]。這一方法操作簡單、成本低，無需特殊試劑和培養基，但僅可檢測到產碳青霉烯酶的腸桿菌科細菌。主要步驟為：將大腸埃希菌（ATCC 25922）用無菌0.9%氯化鈉溶液配制成0.5麥氏濁度的菌懸液，10倍稀釋后涂布于M-H平板，在M-H平板上貼厄他培南或美羅培南紙片，用接種環以厄他培南或美羅培南為中心向平板邊緣劃1條接種線，35℃培養16～20 h后，如大腸埃希菌呈矢狀生長，則判讀為陽性，該待測菌產碳青霉烯酶；若未出現大腸埃希菌生長增強現象，則判讀為陰性，該待測菌株不產碳青霉烯酶。

2.1.3 紙片篩選及協同試驗 2017年，CLSI推薦采用改良碳青霉烯類抗菌藥物滅活試驗（carbapenem inactivation method，CIM）進行CRE的篩查，CIM可檢出多種碳青霉烯類耐藥基因型[9-10]。紙片協同試驗是另外一種簡單、易操作的CRE檢測方法，該方法以碳青霉烯類抗菌藥物紙片與碳青霉烯類抗菌藥物加乙二胺四乙酸紙片抑菌環直徑相差5 mm或5 mm以上判讀為金屬酶陽性；碳青霉烯類抗菌藥物紙片與碳青霉烯類抗菌藥物加苯硼酸紙片的抑菌環直徑相差5 mm或5 mm以上判讀為KPC型碳青霉烯酶陽性[11]。這一方法主要根據不同類別的碳青霉烯酶選擇不同的酶抑制劑以檢測CRE。

2.1.4 美國疾病預防與控制中心推薦的肉湯富集法及改良法 在5 mL胰酪胨大豆肉湯中加入1片含10 μg厄他培南或美羅培南的紙片，將待測樣本接種于肉湯中，35℃培養過夜。吸取100 μL培養過夜的肉湯接種于麥康凱平板，于35 ℃培養箱中培養過夜。挑取麥康凱平板上分解乳糖的單個菌落，采用改良Hodge試驗檢測菌株產酶情況，采用Hodge試驗陽性菌株進行鑒定確認是否為CRE[12]。改良方法：用棉簽挑取適量糞便（約火柴頭大小）接種到5 mL糞便增菌肉湯，35℃孵箱中孵育8～12 h。挑取1環第1次肉湯增菌后的增菌液接種到0.3 μg/mL美羅培南中國藍平板上，35℃孵箱中孵育8～12 h，含藥平板上生長的菌落經基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS）鑒定為腸桿菌科細菌即為CRE[13]。

2.1.5 CRE顯色篩選培養基篩選法 CRE顯色篩選培養基篩選法的檢測原理是通過特異性的顯色酶底物來鑒定菌種。培養基中含有特定的碳青霉烯類抗菌藥物和抑制劑，可抑制敏感菌株和雜菌生長。通過改變顯色培養基中的抗菌藥物和抑制劑濃度，可以優化顯色培養基檢出CRE的敏感性和特異性[14]。

2.1.6 Carba NP試驗 2015年，CLSI推薦采用Carba NP（CNP）試驗檢測CRE，檢測原理為：細菌抽提物水解亞胺培南從而改變溶液pH值，通過pH指示劑的顏色變化進行結果判讀。該方法快速、簡單、成本低，無需設備，大部分微生物實驗室均可以開展，可同時檢測多種碳青霉烯酶。但此方法不適用于檢測染色體編碼的OXA型碳青霉烯酶，而且檢測產ESBL或AmpC合并膜孔蛋白缺失的菌株時，會出現假陽性結果，因此僅適用于檢測腸桿菌科細菌[8]。

3 基于聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）和測序技術的篩查方法

基于PCR的耐藥基因檢測不僅可以檢測細菌是否攜帶碳青霉烯酶基因，還可以結合測序技術確定耐藥基因亞型，具有準確、靈敏、特異的優點。但該檢測方法需要特殊的實驗室場地和儀器，對人員要求高，無法檢測出未知的碳青霉烯酶基因。PCR檢測CRE的敏感性高達97%，明顯高于顯色培養篩選，與培養法比較，檢測時間明顯縮短（P＜0.000 1）[15]。

4 基于MALDI-TOF MS技術的篩查方法

MALDI-TOF MS技術在微生物鑒定中已日趨成熟，而且也可以用于檢測CRE，其原理是將待測菌株與碳青霉烯類抗菌藥物共同培養，采用MALDI-TOF MS技術檢測培養上清液中碳青霉烯類抗菌藥物的特征峰是否消失，從而判讀待測菌株是否產碳青霉烯酶，靈敏度為96.67%、特異性為97.87%[16]。以不同碳青霉烯類抗菌藥物作為底物，CRE的檢出率也不同，以厄他培南為水解底物時，其檢出率為100%；而以亞胺培南為水解底物時，其檢出率為96.6%[17]。相關報道也證實了MALDI-TOF MS技術檢測CRE與表型檢測方法的符合率為100%，其中包括不同型別，如KPC型、VIM型和OXA-48型碳青霉烯酶[18]。

5 其他分子診斷方法

采用環介導等溫擴增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP）技術檢測KPC基因，可在68℃條件下特異性擴增KPC基因，其他β-內酰胺酶基因不產生非特異性擴增，靈敏度可達100 CFU/mL，是普通PCR的10倍，檢測時間只需要25 min；該方法還可以直接檢測各類樣本中的耐藥基因，如痰液、尿液、糞便和血液樣本等[19]。另外一種基于實時熒光PCR的高靈敏度的檢測方法為XpertCarba-R法，該方法可以同時檢測KPC、NDM、VIM、IMP和OXA-48等多種耐藥基因，檢測正確率為97.6%，但需要特殊設備，且耗材成本較高[20]。

6 展望

隨著國內外CRE的快速播散，給臨床抗感染治療帶來了極大的挑戰，各種CRE檢測方法的開發、應用和普及，尤其是像MALDI-TOF MS等分子生物學快速檢測方法的應用，可以快速檢測耐藥菌株，明確CRE，為臨床感染性疾病的診治及醫院感染的控制爭取寶貴時間。隨著這些新技術、新方法的應用，相信在不久的將來，我國及世界CRE可以得到有效控制。