昆蟲病原真菌鑒定方法研究進展

黃 姍 孔麗娜 閆金國 王大鵬

（濰坊護理職業學院，山東青州 262500）

昆蟲病原真菌是能侵入昆蟲體內寄生，從而使昆蟲發病致死的一類真菌的統稱，也稱蟲生真菌。在農業生產中，蟲生真菌能有效控制害蟲種群數量。據統計，60%的死亡昆蟲是由真菌流行病發生引起的[1]。昆蟲病原真菌種類多，寄主范圍廣，安全有效，不傷害天敵，不易產生抗性，在害蟲控制上具有獨特優勢。早在20世紀80年代，昆蟲病原真菌的研究就得到了廣泛重視，而其種類的精確鑒定和系統發育進化關系的分析是研究的前提?；诖?，本文對昆蟲病原真菌主要的鑒定方法進行總結，從鑒定原理、應用現狀及取得的成果等方面進行論述，以期為昆蟲病原真菌的系統發育進化關系分析、精確的分類鑒定及菌種資源開發提供理論指導。

1 昆蟲病原真菌的形態學鑒定

真菌的形態學鑒定是指依據真菌的形態特征和生理生化等特性進行分類的一種鑒定方法。昆蟲病原真菌的形態特征主要包括菌落特征和顯微特征兩個方面，形態學鑒定一般先通過菌落特征初步對真菌進行分類，再通過顯微鏡觀察真菌孢子的形態，進一步確定真菌的種屬。近年來，自動成像分析、電子顆粒體積、分數幾何學分析等現代形態學技術的發展明顯提高了真菌形態學鑒定的準確率。但由于描述真菌表型的各種詞語具有很大的主觀性，沒有統一特定的標準，加之真菌種類繁多、形態特征復雜，某些表型特征不穩定，易受環境影響，形態學鑒定具有很大的局限性。

2 昆蟲病原真菌的分子生物學鑒定

2.1 基于PCR的核酸序列分析 PCR技術的出現使真菌鑒定有了新的突破。編碼核糖體rDNA分子的基因序列因其結構上的高度保守性和基因間隔區（IGS）的多變性，被廣泛應用于揭示生物進化發育關系。目前，在真菌鑒定中應用最廣泛的核酸序列是核糖體rDNA的轉錄間隔區ITS（位于28SrDNA的3′端與18SrDNA的5′端之間的序列稱為核糖體內轉錄間隔區ITS，ITS1位于18SrDNA和5.8SrDNA之間，ITS2位于5.8SrDNA和28SrDNA之間）。在真菌的分類鑒定中，核糖體小亞基編碼基因18SrDNA和基因間隔區（ITS）序列是最常用的。以上序列分析可以鑒定到種、亞種、變種甚至菌株的水平[2]。相關學者分析了20個種的轉錄間隔區ITSl和ITS2序列，發現這兩個序列僅在種間存在差異，種內是完全一致的[3]。邱君志等的研究發現16株座殼孢核糖體大亞基LSUrDNA序列的分子聚類結果與其形態學鑒定結果一致，這表明核糖體大亞基LSUrDNA序列可用于本屬種和種以下分類單元的鑒定[4]。目前，國內外一般利用PCR擴增病原菌核糖體轉錄間隔區ITS進行病原菌的鑒定、檢測及病害診斷。此方法具有快速、準確、簡便等優點，深受微生物學家的重視，為昆蟲病原真菌的分子生物學研究奠定了重要基礎。

目前，ITS序列提供的遺傳信息有限，有時并不能有效區分關鍵進化節點。近年來，逐漸廣泛應用的多基因序列聯合分析技術極大地提高了微生物系統進化分析及種類鑒定的準確性。Kepler等基于ITS、GAPDH、CAL、ACT、CHS多基因聯合分析，對膠孢炭疽菌復合體Colletotrichum gloeospori-oides complex進行了系統進化分析[5]。重慶大學王萌等采用管家基因ef1-α、rpb1、rpb2、β-tubulin聯合對10株綠僵菌菌株的分類地位進行了系統進化分析。研究結果表明，通過單基因及多基因聯合序列分析能更準確地對供試菌株進行分類鑒定[6]。

2.2 基于限制性內切酶的限制性片段長度多態性分析 限制性片段長度多態性RFLP是利用限制性內切酶對不同的基因組進行酶切得到長短、種類、數目不同的限制性片段對真菌進行鑒定的方法。RFLP技術不僅適用于昆蟲病原真菌群體水平的研究，還適用于系統發育進化分析方面的研究。但RFLP技術依然存在缺陷性，這是因為限制性酶切圖譜中特征性的條帶主要是基因組DNA中具有高度重復序列的酶解片段，如mtDNA和rDNA，但mtDNA或rDNA在生物進化演變過程中均是保守序列，產生的RFLP是有限的，并不能完全反映不同菌株之間存在的差異。

2.3 隨機擴增多態性DNA分析 隨機擴增多態性DNA分析是基于PCR的分析技術。擴增的產物通過凝膠電泳顯示DNA片段的數量和大小，可以反應DNA片段的多態性，從而比較菌株之間存在的基因差異。此技術具有用量少、鑒定迅速等優點，被廣泛應用于絲狀真菌的鑒定、分類研究，特別適用于遺傳背景不清的基因分析。

2.4 PFGE技術 脈沖電場凝膠電泳技術在真菌的分離鑒定中應用廣泛。時連根等的研究發現，白僵菌的3種菌株6條染色體的大小在供試的3個菌株間存在差異，其核型在各菌株間存在多型性，3個菌株的染色體大小在2.5～7.2 Mbp，核型大小在26.5～29.0 Mbp[7]。

采用PFGE技術得到的核型圖譜為真菌分類提供了依據。研究發現，金龜子綠僵菌、白僵菌屬和彎頸霉屬存在種的特異性和種內核型多態性。核型多態性的研究將隨著脈沖電泳技術的進一步改進而得到更加廣泛深入的發展，更多的同源DNA探針也將應用于染色體DNA進行分子雜交。

當然，PFGE技術還存在一些問題，如不能有效分離分子量相近的染色體DNA，脈沖電泳中分離的每一條染色體帶不純，目的染色體上獲得的DNA片段易被污染，DNA降解造成的分型失敗等，這些問題都需進一步研究改進。

3 結語

綜上所述，昆蟲病原真菌的分類鑒定可采用多種方法，但每種方法都存在優缺點，研究者應該根據實際情況加以選擇，或將多種方法相結合共同確定蟲生真菌的分類。