結核分枝桿菌相關γ -干擾素定量檢測在脊柱結核診斷中的應用

康新桂，周海洋，徐娟麗，周 飛，王中興，王 睿

南京市中西醫結合醫院骨科，南京 210014

脊柱結核是最常見的骨與關節結核，其較高的致殘率及逐年增長的發生率嚴重影響患者的生活質量，是全球性的公共衛生問題［1］。病原學檢查與菌種鑒定因周期長、操作繁瑣、存在潛在風險等原因，遠不能滿足脊柱結核的早期診斷。近年來，基于結核感染免疫學診斷的新技術——結核分枝桿菌相關γ -干擾素定量檢測（TB-IGRA）在結核病的診斷方面顯示出較高的應用價值［2］。目前有2 種成熟的TB-IGRA 技術：一種是酶聯免疫吸附試驗（ELISA），主要檢測T 細胞經特異性抗原刺激后在全血中釋放的γ -干擾素；另一種是酶聯免疫斑點試驗（ELISPOT），是將單核細胞從全血中分離出來，在體外環境中培養并檢測在特定刺激下分泌γ-干擾素的T 細胞數量。這2 種方法原理相似，但在檢測技術和具體操作上略有不同［2-3］。TB-IGRA 在肺結核的早期診斷方面應用廣泛，但在脊柱結核中的研究相對較少。本研究通過比較TB-IGRA 中的ELISA 法與其他結核檢測方法在診斷脊柱結核方面的差異，分析TB-IGRA 在脊柱結核診斷中的應用價值。

1 資料與方法

1.1 研究對象

選取2017年1月—2017年6月本院骨科收治的疑似脊柱結核病例。收集并整理患者的基本信息、影像學資料、合并癥、病理報告及外周血TB-IGRA、抗結核抗體（TB-Ab）檢測結果，所有患者均采用手術治療，并于術中留取病理標本，對膿液較多的患者行利福平耐藥實時熒光定量核酸擴增檢測（Xpert MTB/RIF）。結合最終臨床診斷，分為脊柱結核組和非脊柱結核組。脊柱結核組納入標準：①患者X 線片、CT 及MRI 具備脊柱結核特征（如死骨、椎間隙變窄、冷膿腫形成等）；②病理報告結果符合結核改變（如凝固性壞死、結核性肉芽腫等）；③細菌培養排除非結核分枝桿菌感染；④經規范抗結核治療后，患者的臨床癥狀（腰背僵硬、盜汗、午后低熱、乏力等）明顯好轉；⑤脊柱結核患者抗結核治療時間＜ 2 周。非脊柱結核組納入標準：明確診斷為其他疾病，X 線片或CT 報告無肺結核改變，無傳染性結核患者接觸史。

1.2 研究方法

1.2.1 TB-IGRA TB-IGRA 診斷試劑盒（ELISA 法）購自北京萬泰生物藥業股份有限公司。患者入院第2 天清晨采集空腹靜脈血標本，分別加入到對照管、檢測管及陽性對照管中，每種培養管分裝約1 mL 血液標本，充分混勻后置于37℃培養22 h，3 000 r/min 離心10 min（離心半徑10 cm），分離血漿，然后通過ELISA 法檢測γ -干擾素含量。檢測管γ -干擾素含量與對照管的差值≥14 pg/mL，且≥25%對照管判斷為陽性，結核分枝桿菌感染可能性高。

1.2.2 TB-Ab檢測

TB-Ab ELISA 檢測試劑盒購自上海奧普生物醫藥有限公司。取患者第2 天清晨空腹靜脈血標本，離心后取血清，將血清加到檢測孔中，15 ～ 20 min內觀察并記錄檢測結果。陽性判斷標準為對照線與檢測線均出現紫紅色線條；陰性判斷標準為僅對照線出現紫紅色線條；無效判斷標準為對照線與檢測線均不顯示，需要重新檢測。

1.2.3 Xpert MTB/RIF

Xpert MTB/RIF 檢測試劑盒購自美國Cepheid公司。對術中膿液較多的患者行Xpert MTB/RIF。術中用注射器吸取病灶區域的膿液，送至實驗室后加入1.5 mL 標本處理液，輕輕晃勻，37℃孵育15 min；然后再次晃勻，室溫孵育5 min，取2 mL置于標本盒，隨后將標本盒置于全自動醫用聚合酶鏈式反應（PCR）儀（Gene Xpert Dx System，美國Cepheid 公司）中，自動進行樣本過濾與洗滌。用超聲溶菌釋放出DNA 后與PCR 反應試劑混合，進行半巢式實時擴增并檢測熒光信號，2 h 后儀器自動給出檢測結果。若檢測到rpoB 基因，則認為結核分枝桿菌檢測陽性。

1.2.4 病理學檢測

將術中所取標本置于10%中性甲醛溶液中固定＞ 24 h，隨后常規行脫鈣、切片、蘇木精-伊紅染色，顯微鏡下觀察。陽性判斷標準為鏡下觀察到干酪樣壞死、結核結節及郎格罕巨細胞等。

1.3 統計學處理

采用SPSS 13.0 軟件對數據進行統計學分析。計量資料以表示；計數資料以例數和百分數表示，組間比較采用χ2檢驗。以最終臨床診斷結果為金標準，計算TB-IGRA、TB-Ab 檢測、Xpert MTB/RIF及病理學檢測4 種方法診斷脊柱結核的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值。不同檢測方法間的一致性采用kappa 一致性檢驗；以P ＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 一般情況

所有患者入院后均接受TB-IGRA、TB-Ab 及病理學檢側，23 例術中膿液較多的患者接受Xpert MTB/RIF。確診或高度懷疑脊柱結核病（脊柱結核組）28 例，男16 例、女12 例，年齡31 ～ 68（46.0±9.4）歲；合并高血壓病6 例，糖尿病9 例，口服激素者2 例。確診非脊柱結核（非脊柱結核組）16 例，男10 例、女6 例，年齡28 ～ 64（44.0±8.2）歲；其中腫瘤2 例，脊柱炎14 例；合并高血壓病6 例，糖尿病4 例。

2.2 TB-IGRA、TB-Ab 檢測、Xpert MTB/RIF 和病理學檢測結果

TB-IGRA、TB-Ab 檢測、Xpert MTB/RIF 和病理學檢測的靈敏度、特異度、陽性預測值和陰性預測值結果見表1。χ2檢驗結果表明，TB-IGRA 與TB-Ab檢測結果差異有統計學意義（P ＜ 0.05），TB-IGRA與Xpert MTB/RIF 及病理學檢測結果差異無統計學意義（P ＞ 0.05）。kappa一致性檢驗結果顯示，TB-IGRA與TB-Ab 檢測結果一致性較差（κ = 0.25），TB-IGRA與Xpert MTB/RIF 及病理學檢測結果一致性較高（κ = 0.68、0.71）。

3 討 論

近年來，脊柱結核的感染人數呈增長趨勢，由于其病程漫長、病情隱蔽，發病早期往往不被患者重視，直至出現神經功能障礙、脊柱骨質破壞、形成竇道時才被發現［2，4］。從某種程度來說，脊柱結核是一種消耗性內科疾病，如能夠早期診治，不僅能遏制疾病的發展，減輕患者并發癥，降低死亡率，還有可能達到不經手術治療而治愈的目的［5-6］。細菌學檢查是脊柱結核確診的可靠標準，但細菌學培養周期長、操作繁瑣，而且非典型結核及抗結核藥物的應用降低了結核分枝桿菌培養的陽性率，不能很好地滿足臨床診斷的需求［7-8］。

脊柱結核主要影響患者的細胞免疫系統，細胞免疫中的T 淋巴細胞經結核特異性抗原刺激后，形成活化的效應T 細胞。這些T 淋巴細胞在體外經結核分枝桿菌特異性抗原——早期分泌靶抗原6（ESAT-6）和培養濾液蛋白10（CFP-10）刺激后可分泌細胞因子γ -干擾素。TB-IGRA是一種檢測結核感染的新方法，該方法通過檢測γ -干擾素濃度及表達γ -干擾素細胞的數量來評估機體是否遭受結核感染［9］。ESAT-6 和CFP-10 具有高度特異性，在卡介苗及非結核菌中幾乎不表達，大大降低了臨床檢測的假陽性率［1，10］。有研究顯示，TB-IGRA 診斷肺結核的靈敏度為84.85%、特異度為86.67%［9］，診斷骨與關節結核的靈敏度為86.7%、特異度為61.9%［11］。汪鍇等［12］發現TB-IGRA（ELISPOT 法）診斷脊柱結核的靈敏度和特異度分別為93.5%和91.7%，而TB-Ab 檢測的靈敏度和特異度分別為61.3%和72.2%。由此可見，不同研究、不同部位結核之間TB-IGRA 的靈敏度和特異度有較大差異。本研究發現，TB-IGRA（ELISA 法）檢測脊柱結核的靈敏度和特異度分別為85.7%和68.8%，稍低于汪鍇等［12］的研究，考慮為患者個體、區域差異及研究者所制訂的脊柱結核診斷標準不同等原因所致。本研究發現TB-Ab 檢測的靈敏度和特異度為53.6%和87.5%，該結果與汪鍇等［12］的研究相近。值得注意的是，TB-IGRA 與TB-Ab 結果比較差異有統計學意義，兩者結果之間一致性較差（κ = 0.25），這與以往研究觀點一致［12］。

脊柱結核的病理學改變主要有2 種類型，即增殖型病變和干酪樣滲出型病變。一些非典型結核病變僅依據臨床癥狀、影像學等檢查很難確定是否為結核分枝桿菌感染，病理學檢查較好地解決了這一難題［13］。Yuan 等［10］發現非典型脊柱結核患者中88.5%的病理檢查符合結核分枝桿菌感染的病理特點，TB-IGRA 的靈敏度和特異度分別為82.8%和81.3%，并認為非典型脊柱結核患者的營養狀況及年齡可能影響TB-IGRA 的陽性率。本研究發現，28 例確診或高度懷疑脊柱結核組中有26例的病理結果高度提示結核感染，病理學檢查的陽性率與TB-IGRA 的陽性率之間差異無統計學意義，且兩者結果之間具有高度一致性（κ = 0.71）。由此可見，TB-IGRA 雖然不能確定結核病灶的位置及是否處于活動期，但診斷方便快捷、靈敏度高、無需病灶取材，是一種很好的脊柱結核輔助診斷方法［8］。

Xpert MTB/RIF 是一種新的分子檢測方法，在結核分枝桿菌和利福平耐藥性的診斷中受到關注［14］，在肺內及肺外結核的診斷中均有很好的應用價值［15］。Wang等［16］依據脊柱結核診斷的綜合參考標準（包括臨床表現、實驗室檢查、病理學檢查、放射學檢查及18個月的隨訪調查），發現Xpert MTB/RIF 的靈敏度（85.27%）明顯高于病理學檢測（73.04%）。李禎［17］采用相似的綜合參考標準，發現Xpert MTB/RIF同樣具有很高的靈敏度（78.7%）。本研究發現Xpert MTB/RIF的靈敏度為68.8%，較上述研究結果偏低。綜合分析本研究患者的臨床特點，發現個別患者口服激素類藥物，可能在不同程度上降低了Xpert MTB/RIF 的靈敏度；本研究樣本量相對較少，且針對脊柱結核的診斷標準與上述研究有差異，這都可能造成本研究中Xpert MTB/RIF靈敏度較上述研究結果偏低。此外，不同的取材方式（開放手術、超聲定位穿刺及活組織檢查）［18］、取材部位（膿液、肉芽組織和干酪樣壞死組織）［19］所檢測的Xpert MTB/RIF 靈敏度有較大差異。目前尚無Xpert MTB/RIF與TB-IGRA的對照研究，本研究發現Xpert MTB/RIF 的靈敏度（68.8%）低于TB-IGRA（85.7%），但2種檢測方法的陽性率間差異無統計學意義，且檢測結果之間有較高一致性（κ = 0.68）。

綜上所述，TB-IGRA 診斷脊柱結核具有良好的靈敏度和特異度，檢測方法方便、快捷，尤其適用于不方便獲取病灶組織的患者，在脊柱結核的輔助診斷方面有很好的應用前景。然而本研究為小樣本量的回顧性研究，下一步本研究組將進行較大樣本量的前瞻性研究來進一步驗證本研究結果。本研究中部分患者患有高血壓、糖尿病、免疫功能低下（口服激素）等疾病，個別患者術后、出院前與入院時相比TB-IGRA 檢測結果出現明顯波動，而且淋巴細胞的減少可能對TB-IGRA 的檢測結果有影響，因此，合并癥、藥物、手術干預及外周血（淋巴細胞等）數量對TB-IGRA 的影響仍有待進一步研究。