上皮細(xì)胞型與混合型葡萄膜黑色素瘤的生物信息學(xué)分析

陳 源，黃正如

0引言

葡萄膜黑色素瘤(uveal melanoma,UM)是一種少見(jiàn)的，但也是成人最常見(jiàn)的原發(fā)性眼內(nèi)惡性腫瘤，約占眼部惡性黑色素瘤的85%[1]。UM的治療方式主要有激光、放射治療、眼球摘除及眶內(nèi)容剜除術(shù)。但該病的療效較差、患者生存率較低，5a總生存率為69%，15a為55%，25a為51%[2]。根據(jù)1980年WHO分類(lèi)法，UM可分為：梭形細(xì)胞型、上皮細(xì)胞型、混合型和其他型。UM的惡性程度與病理類(lèi)型有關(guān)，以上皮細(xì)胞型惡性程度最高，混合細(xì)胞型次之，梭形細(xì)胞型相對(duì)較好[3-4]。UM的基因表達(dá)變化與該病的發(fā)展、轉(zhuǎn)移等相關(guān)[5-6]。針對(duì)UM的病理分型和基因表達(dá)進(jìn)行研究，對(duì)揭示該病的病理機(jī)制、治療及預(yù)后具有重要的意義。近年來(lái)，基因芯片技術(shù)和生物信息學(xué)分析方法被廣泛應(yīng)用于多種疾病特別是腫瘤的研究中。篩選差異基因(differentially expressed genes,DEGs)及其功能富集分析等生物信息學(xué)方法有助于從基因?qū)用娼沂灸[瘤的病理機(jī)制，并為臨床治療及預(yù)后評(píng)估提供支持。本研究使用生物信息學(xué)方法，通過(guò)對(duì)基因芯片數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，對(duì)上皮型和混合型UM進(jìn)行了初步探討。

1材料和方法

1.1材料數(shù)據(jù)下載所用的數(shù)據(jù)來(lái)自美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心Gene Expression Omnibus(GEO)數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)。所用數(shù)據(jù)集GSE22138使用的是Affymetrix公司基因芯片，其平臺(tái)號(hào)為GPL570[HG-U133_Plus_2]Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array。該數(shù)據(jù)集中含有23例混合型及21例上皮細(xì)胞型人葡萄膜黑色素瘤的基因芯片信息。

1.2方法

1.2.1差異基因的篩選和功能富集分析GEO2R是GEO數(shù)據(jù)庫(kù)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r)內(nèi)含的交互式的網(wǎng)絡(luò)工具，能夠通過(guò)R語(yǔ)言篩選出不同實(shí)驗(yàn)條件下的差異表達(dá)基因。本研究通過(guò)GEO2R篩選出上皮型相對(duì)于混合型葡萄膜黑色素瘤的差異基因。設(shè)置篩選標(biāo)準(zhǔn)為：logFC≥1及l(fā)ogFC≤-1，P<0.05，挑選出有明顯表達(dá)差異且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的基因；再通過(guò)R語(yǔ)言作火山圖對(duì)結(jié)果進(jìn)行表達(dá)。

1.2.2差異基因的功能富集分析DAVID生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)(http://david.ncifcrf.gov)是一款在線(xiàn)的整合了生物學(xué)數(shù)據(jù)和分析工具的數(shù)據(jù)庫(kù)，該數(shù)據(jù)庫(kù)為大規(guī)模的基因或蛋白列表提供系統(tǒng)整合的生物功能注釋信息。京都基因和基因組百科全書(shū)(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)是系統(tǒng)分析基因功能的數(shù)據(jù)庫(kù)，被廣泛應(yīng)用于整合和解釋基因組測(cè)序和其他高通量實(shí)驗(yàn)中得到的大規(guī)模數(shù)據(jù)集。基因本體論(Gene Ontology,GO)是多種生物本體語(yǔ)言中的一種，提供了三層結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)定義方式，如生物學(xué)途徑(biological process,BP)，細(xì)胞組件(cellular component,CC)，分子功能(molecular function,MF)，用于描述基因產(chǎn)物的功能。本研究通過(guò)DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)差異基因的功能進(jìn)行富集分析，取有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異且排名前10位的富集結(jié)果，通過(guò)R語(yǔ)言作氣泡圖對(duì)結(jié)果進(jìn)行表達(dá)；并對(duì)上調(diào)和下調(diào)的差異基因作表對(duì)富集結(jié)果進(jìn)行表達(dá)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2.3蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和關(guān)鍵基因的篩選及其相互作用分析STRING數(shù)據(jù)庫(kù)(http://string-db.org)可用于搜尋已知蛋白質(zhì)之間和預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)之間的相互作用，便于更加深入地了解蛋白質(zhì)的功能及調(diào)控機(jī)制。本研究通過(guò)STRING查找差異基因的蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network,PPI network)，以綜合評(píng)分>0.4為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Cytoscape是用于可視化分子互作網(wǎng)絡(luò)的工具，其MCODE插件是基于拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)尋找具有密切相互作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的插件。本研究應(yīng)用Cytoscape中的MCODE插件，以MCODE Scores>5，Degree Cutoff=2,Node Score cutoff=0.2,Max Depth=100及K-Core=2為標(biāo)準(zhǔn)，篩選關(guān)鍵基因。cBioPortal(http://www.cbioportal.org)為癌癥基因組研究提供了一個(gè)網(wǎng)頁(yè)版面用來(lái)瀏覽、可視化和分析多維度的癌癥基因組數(shù)據(jù)。對(duì)于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)cBioPortal通過(guò)基因互作數(shù)據(jù)庫(kù)，尋找與候選基因相關(guān)聯(lián)的基因，通過(guò)分析互作強(qiáng)弱并構(gòu)建調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。本研究應(yīng)用cBioPortal分析和構(gòu)建關(guān)鍵基因的關(guān)聯(lián)基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.2.4關(guān)鍵基因在UM中的生存分析GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)(http://gepia.cancer-pku.cn/)為分析癌癥的差異基因表達(dá)、降維分析、相關(guān)性分析、類(lèi)似基因檢測(cè)和生存分析等提供支持。本研究應(yīng)用GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)關(guān)鍵基因在UM中的作用進(jìn)行了生存分析。

2結(jié)果

2.1上皮型和混合型人葡萄膜黑色素瘤中的差異基因及其篩選本研究共篩選到UM兩種病理型(上皮細(xì)胞型和混合型)之間的差異基因241個(gè)。上皮細(xì)胞型相對(duì)于混合型UM，下調(diào)的差異基因116個(gè)和上調(diào)125個(gè)(圖1A)。

2.2差異基因的KEGG和GO功能富集分析本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)工具DAVID對(duì)進(jìn)入納入標(biāo)準(zhǔn)的差異基因進(jìn)行了功能富集分析。綜合而言，生物學(xué)途徑(BP)，差異基因功能主要富集于細(xì)胞粘附、藥物反應(yīng)以及內(nèi)皮細(xì)胞的增殖等方面；細(xì)胞組件(CC)，主要富集于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、細(xì)胞質(zhì)、線(xiàn)粒體等；分子功能(MF)主要富集于蛋白質(zhì)同聚活性、微管結(jié)合、TAU蛋白結(jié)合等；KEGG信號(hào)通路(KEGG pathway)則主要富集于局部粘附、鈣信號(hào)通路、縫隙連接及氨基酸的生物合成等方面(圖1B、C)。分別就上、下調(diào)的差異基因而言，下調(diào)的基因中，BP主要富集于細(xì)胞及生物粘附、凋亡、細(xì)胞程序性死亡及細(xì)胞分化等，CC主要富集于細(xì)胞突起、IkappaB激酶復(fù)合物及不溶解組分等，MF主要富集于TAU蛋白結(jié)合、蛋白二聚化、相同蛋白質(zhì)結(jié)合等；上調(diào)的基因，BP主要富集于DNA的解聚、細(xì)胞增殖、細(xì)胞大分子分解過(guò)程、細(xì)胞內(nèi)傳遞及對(duì)放療的反應(yīng)等，CC主要富集于細(xì)胞囊泡、線(xiàn)粒體及其組分、細(xì)胞質(zhì)囊及細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)合囊泡等；MF主要富集于輔酶、核苷及FAD結(jié)合等；KEGG富集于Ca2+信號(hào)通路和聚糖生物合成，見(jiàn)表1。

2.3蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和關(guān)鍵基因的篩選及其協(xié)作基因網(wǎng)絡(luò)分析本研究中應(yīng)用Cytoscape對(duì)DEGs構(gòu)建PPI的可視化結(jié)果見(jiàn)圖2A，運(yùn)用MCODE插件篩選出PPI的顯著組件見(jiàn)圖2B，根據(jù)設(shè)置的標(biāo)準(zhǔn)，篩選出的10個(gè)關(guān)鍵基因如下：表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)、纖維生長(zhǎng)因子13(fibroblast growth factor 13,FGF13)、干擾素α誘導(dǎo)蛋白6(interferon alpha inducible protein 6,IFI6)、干擾素誘導(dǎo)蛋白的四肽重復(fù)序列1(interferon induced protein with tetratricopeptide repeats 1,IFIT1)、ISG15泛素樣修飾劑(ISG15 ubiquitin like modifier,ISG15)、JUN原癌基因AP-1轉(zhuǎn)錄因子亞基(Jun Proto-oncogene,AP-1 transcription factor subunit,JUN)、GTP酶樣發(fā)動(dòng)蛋白MX(MX Dynamin like GTPase 1,MX1)、2’-5’-寡腺苷酸合成酶1(2’-5’-Oligoadenylate Synthetase 1,OAS1)、SRY盒9(SRY-Box 9,SOX9)、分泌型磷蛋白1(secreted phosphoprotein 1,SPP1)。其中Node Degree最高的為EGFR，具有29個(gè)關(guān)聯(lián)節(jié)點(diǎn)，提示該基因在UM中起著樞要作用。通過(guò)cBioportal對(duì)關(guān)鍵基因的協(xié)作基因網(wǎng)絡(luò)的實(shí)現(xiàn)可視化，結(jié)果見(jiàn)圖2C。

2.4關(guān)鍵基因在UM中的生存分析關(guān)鍵基因的表達(dá)高低其對(duì)UM的生存影響的分析見(jiàn)圖3，結(jié)果表明對(duì)于總體生存率(overall survival,OS)而言，EGFR、FGF13、IFI6、IFIT1、ISG15、JUN、MX1、OAS1高表達(dá)的人群生存率更低，而基因如SOX9、SPP1高表達(dá)的人群則生存率更高。

表1 上調(diào)、下調(diào)差異基因的GO和KEGG通路富集分析

類(lèi)別注釋倍率P上調(diào)基因生物學(xué)途徑DNA分解代謝過(guò)程40.007875生物學(xué)途徑細(xì)胞增殖90.00959生物學(xué)途徑細(xì)胞大分子分解代謝過(guò)程120.009985生物學(xué)途徑胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)170.010126生物學(xué)途徑對(duì)放療的反應(yīng)60.011711生物學(xué)途徑神經(jīng)元投射的形態(tài)發(fā)生60.015032生物學(xué)途徑細(xì)胞運(yùn)動(dòng)90.015453生物學(xué)途徑高分子分解過(guò)程120.016675生物學(xué)途徑乙酰輔酶A代謝過(guò)程30.018718生物學(xué)途徑單糖轉(zhuǎn)運(yùn)30.018718細(xì)胞組件囊泡140.001082細(xì)胞組件線(xiàn)粒體部分130.001226細(xì)胞組件線(xiàn)粒體180.001977細(xì)胞組件細(xì)胞質(zhì)囊泡130.002325細(xì)胞組件細(xì)胞膜結(jié)合囊泡110.006562分子功能輔酶結(jié)合60.008435分子功能核苷結(jié)合200.01345分子功能黃素腺嘌呤二核苷酸結(jié)合40.013617分子功能連接酶活性,形成碳硫鍵30.014906分子功能電子載體活性60.018669KEGG_PATHWAY鈣信號(hào)通路60.026148KEGG_PATHWAYO-聚糖生物合成30.033334下調(diào)基因生物學(xué)途徑細(xì)胞粘附130.000888生物學(xué)途徑生物粘附130.000899生物學(xué)途徑凋亡調(diào)控140.000917生物學(xué)途徑細(xì)胞程序性死亡的調(diào)控140.001005生物學(xué)途徑細(xì)胞死亡的調(diào)控140.001039生物學(xué)途徑細(xì)胞發(fā)育調(diào)控70.001421生物學(xué)途徑水解酶活性負(fù)調(diào)節(jié)40.002946生物學(xué)途徑中性脂質(zhì)代謝過(guò)程40.00331生物學(xué)途徑細(xì)胞分化過(guò)程中的形態(tài)變化70.003403生物學(xué)途徑神經(jīng)元投射發(fā)育70.004302細(xì)胞組件細(xì)胞投射100.017316細(xì)胞組件Ikappab激酶復(fù)合物20.039309細(xì)胞組件膜片段100.040116細(xì)胞組件不可溶解片段100.048676分子功能Tau蛋白結(jié)合30.000361分子功能蛋白質(zhì)二聚活性100.00551分子功能相同蛋白結(jié)合100.015404分子功能磷脂酰膽堿-甾醇O-酰基轉(zhuǎn)移酶活性20.030061分子功能細(xì)胞骨架蛋白結(jié)合80.033437

3討論

UM來(lái)源于虹膜、睫狀體及脈絡(luò)膜，根據(jù)1980年WHO分類(lèi)法，病理分型為梭形細(xì)胞型、上皮細(xì)胞型、混合細(xì)胞型和其他類(lèi)型：如壞死型、氣球狀細(xì)胞型等。其中混合型是指瘤組織由上皮型、梭形細(xì)胞、小多邊形細(xì)胞等多種形態(tài)的瘤細(xì)胞構(gòu)成。梭形細(xì)胞型的瘤細(xì)胞是一種黏合細(xì)胞，具有較強(qiáng)的凝合力，故不易發(fā)生轉(zhuǎn)移；而上皮樣瘤細(xì)胞為非黏合細(xì)胞，活動(dòng)度大，凝合力差，很容易發(fā)生轉(zhuǎn)移，其預(yù)后亦更差[3]。既往研究證實(shí)基因表達(dá)改變與UM的發(fā)展相關(guān)：位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的BAP1，參與泛素化修飾、促進(jìn)細(xì)胞的凋亡；當(dāng)BAP1發(fā)生突變表達(dá)降低時(shí)，細(xì)胞凋亡受抑制，導(dǎo)致UM的發(fā)生[6]。而SPANX-C在轉(zhuǎn)移性的UM中較非轉(zhuǎn)移表達(dá)明顯升高的特點(diǎn)，使該基因成為UM發(fā)生轉(zhuǎn)移的潛在分子標(biāo)準(zhǔn)物[5]。

圖1差異基因及其功能富集分析A：上皮細(xì)胞型相較混合型UM，在符合條件logFC≥1及l(fā)ogFC≤-1，P<0.05條件的差異基因中，下調(diào)的基因116個(gè)(綠色)和上調(diào)125個(gè)(紅色)；B：KEGG通路富集分析；C：GO功能富集分析，(1)分子功能富集分析；(2)細(xì)胞組件富集分析;(3)生物學(xué)途徑富集分析。

在本研究中，共篩選出差異基因241個(gè)。相較于混合型，上皮細(xì)胞型UM下調(diào)的基因BP主要富集于細(xì)胞及生物粘附、凋亡、細(xì)胞程序性死亡及細(xì)胞分化等，上調(diào)的基因BP主要富集于DNA的解聚、細(xì)胞增殖等，這些功能富集結(jié)果與上皮細(xì)胞型UM惡性程度更高，發(fā)展更快且易轉(zhuǎn)移等臨床特征一致。

本研究通過(guò)Cytoscape所篩選出10個(gè)關(guān)鍵基因，均有與惡性腫瘤相關(guān)的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的報(bào)道。在PPI中，基因EGFR的Node Degree最高，提示其與UM發(fā)展最為密切。EGFR位于細(xì)胞膜表面，是一種跨膜的糖蛋白，當(dāng)其與相應(yīng)的細(xì)胞因子結(jié)合后，則發(fā)生酪氨酸自磷酸化，信號(hào)傳導(dǎo)入胞內(nèi)，發(fā)生細(xì)胞增殖。目前，EGFR與UM癌癥關(guān)系已經(jīng)被實(shí)驗(yàn)所證實(shí)[7]。FGF13是纖維生長(zhǎng)因子家族成員。FGF家族廣泛參與了有絲分裂和促細(xì)胞生存。在乳腺癌的研究[8]中發(fā)現(xiàn)FGF13能夠促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移；在子宮頸癌中，高表達(dá)FGF13的癌細(xì)胞對(duì)化療藥物表現(xiàn)出更高的抵抗作用[9]。IFI6由干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生，能夠抑制細(xì)胞的凋亡，在乳腺癌的研究[10]中發(fā)現(xiàn)IFI6可通過(guò)誘導(dǎo)mROS進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞凋亡并促進(jìn)其轉(zhuǎn)移。而IFIT1的表達(dá)增加與鱗狀細(xì)胞癌的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[11]，同時(shí)，該基因亦被認(rèn)為是乳腺癌的預(yù)后指標(biāo)之一[12]。ISG15基因編碼的蛋白質(zhì)是一種泛素樣蛋白。研究者在胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌的研究中，敲減ISG15后，發(fā)現(xiàn)PDAC細(xì)胞受到抑制，提示ISG15具有抑制胰腺導(dǎo)管細(xì)胞癌的作用[13]。原癌基因JUN的產(chǎn)物為c-JUN，c-JUN表達(dá)增高導(dǎo)致酒精相關(guān)性癌癥發(fā)生率上升[14]。MX1在持續(xù)暴露于紫外線(xiàn)的黑色素瘤細(xì)胞中表達(dá)明顯升高，該基因的表達(dá)上調(diào)能夠抑制黑色素瘤細(xì)胞的凋亡，推測(cè)該基因與黑色素瘤的發(fā)生發(fā)展相關(guān)[15]。OAS1由干擾素誘導(dǎo)產(chǎn)生，研究報(bào)道前列腺癌的發(fā)生與OAS1的基因多態(tài)性相關(guān)[16]。SPP1可以通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞增殖[17]、腫瘤轉(zhuǎn)移[18]及耐藥[19]促進(jìn)癌癥的生存及發(fā)展，在SPP1高表達(dá)的情況下，其生存率更低。SOX9在肝癌、乳腺癌、膀胱癌及胃癌中表達(dá)升高，則患者預(yù)后更差[20]。但本研究中，通過(guò)基因SPP1和SOX9在UM中的生存分析，結(jié)果顯示：這兩種基因在高表達(dá)時(shí)，患者的總體生存率更高，這一結(jié)果不同于兩種基因在其他癌癥中的生存分析結(jié)果，其中原因需待進(jìn)一步研究。根據(jù)生物信息學(xué)篩選的這10個(gè)關(guān)鍵基因，我們查閱文獻(xiàn)，暫未見(jiàn)于上皮型及混合型UM病理分型之間的報(bào)道。

圖2蛋白-蛋白互作網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和關(guān)鍵基因的篩選及其互作基因分析A：差異基因的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，黃色為關(guān)鍵基因；B：通過(guò)MCODE插件篩選出的關(guān)鍵基因組件；C：關(guān)鍵基因的協(xié)作基因網(wǎng)絡(luò)。

圖3關(guān)鍵基因的表達(dá)高低對(duì)UM的總體生存率的影響A-H：FGF13、IFI6、EGFR、MX1、IFIT1、ISG15、OAS1、JUN基因高表達(dá)時(shí)生存率更低，低表達(dá)時(shí)生存率更高；I,J：SOX9、SPP1基因高表達(dá)時(shí)生存率更高，低表達(dá)時(shí)生存率更低。

綜上，本研究通過(guò)生物信息學(xué)方法對(duì)不同病理類(lèi)型(混合型、上皮細(xì)胞型)UM的差異基因進(jìn)行了分析，篩選到了241個(gè)差異基因，其中關(guān)鍵基因10個(gè)，通過(guò)對(duì)這些基因的分析，對(duì)能夠更好地理解發(fā)病機(jī)制，對(duì)疾病的治療和預(yù)后評(píng)估有一定的意義。本研究不足之處在于沒(méi)有在梭型細(xì)胞型及上皮型UM之間進(jìn)行分析，其原因是所查的數(shù)據(jù)中無(wú)梭形細(xì)胞型UM的數(shù)據(jù)。同時(shí)，由于本研究納入的樣本量較小，尚需更大規(guī)模的臨床資料及生物學(xué)實(shí)驗(yàn)研究對(duì)結(jié)果進(jìn)行證實(shí)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。