455～470nm波長的面陣藍光對SD大鼠視網膜組織結構的影響

李慧麗，陳治威，孫小紅，董國軍，王大洪，肖勝燕，李小丹

0引言

近年來，關于光對視網膜的損傷一直是眼科及視光學專業研究的熱點問題，藍光作為高能短波可見光，波長在400～500nm間對視網膜的影響最大，對視網膜具有高度的敏感性及穿透力，故又被稱為“高能可見光”[1]，其對視網膜造成光化學損害已被研究證實。本實驗選取波長為455～470nm的藍光燈珠制成實驗所需的面陣藍光發光器，觀察面陣藍光對SD大鼠視網膜組織結構的影響，討論分析照射時間與視網膜組織結構變化之間的關系。

圖1規格380mm×325mm×180mm聚乙烯PP飼養籠，頂置藍光發光器。

圖2藍光發光器內側面。

圖3藍光發光器外側面。

圖4實驗室環境。

圖5藍光照射整體工作狀態。

圖6正在進行藍光照射的單個飼養籠。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物6周齡雄性SD大鼠24只，體質量400～450g，重慶醫科大學實驗動物中心提供。SPF級動物包房分籠飼養，12h/12h(明暗交替)室溫18℃～20℃，相對濕度40%～70%，通風換氣8～12次/h。實驗SD大鼠均用標準飼料喂養[實驗動物生產許可證：SCXK(渝)2012-0006]。對實驗大鼠行常規眼部檢查，證實其外眼和眼底均正常。動物管理符合動物保護條例并符合動物倫理委員會要求。

1.1.2主要試劑及儀器DAB(diaminobenzidine,DAB二氨基聯苯胺顯色試劑盒)(中杉金橋生物科技有限公司)；粘附載玻片(CITOTEST江蘇世泰實驗器械有限公司)；AR分析純丙酮(天津市科密歐化學試劑有限公司)；冰醋酸(臺山市新寧制藥有限公司)；8%～14%甲醛溶液(重慶川東化工有限公司)；10%的水合氯醛注射液(青島宇龍海藻有限公司)；95%乙醇(四川金山制藥有限公司)；照度計ZD-10(杭州遠方光電信息股份有限公司)；重慶康華瑞明科技股份有限公司協助制作的藍光發光器(圖1)。目前藍光燈珠波長多455～470nm，本實驗我們使用的燈珠波長為455～470nm，主峰462nm(廣東臺宏光電科技有限公司)。雙目生物顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；11800型修塊機(瑞典LKB公司)；8800型超薄切片機(德國Leica公司)。

1.2方法

1.2.1實驗動物分組選取6周齡健康SD雄性大鼠24只，隨機分為正常對照組(n=6)和實驗組(n=18)，正常對照組無任何干預正常喂養6wk；實驗組分為3個小組，每天分別予藍光發光器(455～470nm、391Lx)照射3、6、12h，連續照射6wk。

1.2.2藍光發光器的制備聚乙烯PP飼養籠，規格380mm×325mm×180mm，頂蓋安置藍光發光器(圖1)。發光器由9個大功率藍光LED燈組成，橫向每組串聯3個燈珠，縱向并聯3組，燈珠之間橫向間距9cm，縱向間距12cm(圖2、3)。通過預實驗觀察，發現藍光照射下大鼠活動范圍主要集中在箱底周邊區域，實時測得距離發光器光源20cm處實驗箱底四角及四邊中點照度值為385.2～397.5(均值391)Lx，作為本實驗的照度值(圖4～6)。

1.2.3大鼠眼球壁組織病理學檢查快速頸椎脫臼處死大鼠，分別于大鼠雙眼角膜緣12∶00位縫線做標記，立即摘除眼球，眼球取下后立刻投入AR分析純丙酮50mL+冰乙酸2mL+40%甲醛4mL+蒸餾水3mL的混合液中，固定24h，2h后在眼球標本側面角膜緣開窗，便于固定液滲入，眼球標本繼續再固定2d，取出標本，再轉入80%乙醇浸泡4h，95%乙醇浸泡4h，100%乙醇浸泡4h，脫水固定，二甲苯透明，浸蠟3h，包埋，矢狀面切片，切片厚度4μm，常規HE染色，光學顯微鏡下觀察455～470nm波長的面陣藍光對SD大鼠視網膜組織結構的影響，討論分析照射時間與視網膜組織結構變化之間的關系。

圖7各組大鼠視網膜組織的組織病理學表現(HE×200)A：正常對照組大鼠眼視網膜結構和形態正常；B：3h實驗組大鼠眼脈絡膜纖維結締組織玻璃樣改變(藍箭頭)，小血管增生(黑箭頭)，色素層變薄，細胞稀疏(綠箭頭)，視細胞層細胞數量減少(紅箭頭)；C：6h實驗組大鼠眼脈絡膜層疏松水腫，小血管增生(黑箭頭)，色素層變薄，細胞稀疏(綠箭頭)，神經節細胞層局部胞漿豐富，向內側形成胞突(白箭頭)；D：12h實驗組大鼠眼脈絡膜層疏松水腫小血管增生(黑箭頭)，色素層變薄(綠箭頭)，視細胞顯著減少、萎縮，胞核固縮，局部視細胞消失(紅箭頭)，雙極細胞層及節細胞層變化不明顯。

2結果

正常對照組的大鼠眼脈絡膜結構完整，可見致密纖維結締組織；色素上皮層由2～3層梭形上皮細胞組成，胞質內含少量色素顆粒；視細胞層排列整齊，約10余層視細胞核組成，細胞核結構清楚，雙極細胞層結構完整，細胞排列整齊，約6層細胞核重疊排列，視網膜神經節細胞層呈單層疏松排列，局部可見小血管(圖7A)。藍光照射3h實驗組的大鼠眼脈絡膜致密纖維結締組織玻璃樣改變，局部疏松水腫，小血管增生，色素層變薄，細胞稀疏；視細胞數量減少約5～6層，細胞核染色清晰，雙極細胞層及節細胞層未見明確改變(圖7B)。藍光照射6h實驗組的大鼠眼脈絡膜層疏松水腫，小血管增生；色素層變薄，細胞稀疏，視細胞層細胞數進一步減少，約4～5層，細胞核固縮；雙極細胞層輕度增生，細胞核淡染；神經節細胞層局部胞漿豐富，向內側形成胞突，小血管增生(圖7C)。藍光照射12h實驗組的大鼠眼脈絡膜層疏松水腫，小血管增生；色素層變薄，細胞疏松；視細胞顯著減少、萎縮，細胞核固縮，大部分視細胞層細胞核1～2層，并逐漸減少，局部視細胞消失；雙極細胞層及節細胞層變化不明顯(圖7D)。

3討論

隨著LED光源大量應用，短波藍光造成的潛在視網膜損傷應該引起重視[2]。視網膜是眼組織中最容易受到光輻射損害的部位，1966年Noell等[3]首次建立大鼠視網膜光損傷動物模型。既往研究發現視網膜光損傷主要累及視網膜的光感受器細胞和色素上皮細胞。大鼠的視網膜光感受器視桿細胞約占97.2%，而視錐細胞僅占2.8%[4]。視網膜色素上皮細胞參與視黃醇循環，吞噬脫落的光感受器細胞外節以維持光感受器細胞興奮性，并分泌多種生長因子，幫助維持脈絡膜血管內皮細胞和光感受器細胞的結構完整性[5-7]。既往實驗證明視網膜色素上皮細胞對藍光刺激敏感[8]，損傷可造成血視網膜屏障及跨膜物質轉運發生功能障礙[9-10]，故有研究者認為，藍光損傷主要部位為視網膜的色素上皮細胞，凋亡是其主要表達方式[11]。

而近年來的研究[12]則更多表明藍光照射引起的視網膜光損傷其本質是光感受器的凋亡。每個光感受器細胞外節內含一種感光色素。視桿細胞外節所含感光色素為視紫紅質(rhodopsin)，視紫紅質由11-順視黃醛和視蛋白組成，與光損傷的發生密切相關[13]。視黃醛(retiniod)被稱為A2E(N-retinyl-N-retinylideneethanolamine1)[14-16]，A2E有2個吸收峰，一個在紫外光區335nm處，一個在藍光區的435nm處。A2E對視網膜色素上皮在沒有光照的黑暗條件下沒有毒性，而光照下毒性大大增加。藍光對視網膜的損害是連鎖反應：藍光激發A2E使其釋放自由基離子，自由基離子增大A2E對視網膜色素上皮的損壞，引起視網膜色素上皮萎縮，導致光感受器細胞的凋亡。

既往國內文獻報道多采用點光源藍光照射實驗，點光源所發出的光譜距離垂直中心方向越遠，光照度差異越大。面陣光源在同一平面內照射的范圍較大，距離垂直中心方向光照度差異性小，各個方向的光照度更均勻；國外文獻也有報道使用面陣光源照射模型[17]，其采用高光無間斷照明，將氙燈匯聚成小光束，經過藍色濾光片或綠色濾光片形成藍光束-或綠光束，直接短時間高光照射固定在模具中的大鼠眼睛，其光照時間與光照均勻性的設計與本實驗有區別。

本實驗設計在養殖箱內完成，實驗最好選用一塊同養殖箱底面同樣大小的LED顯示屏照射，但因實際條件所限不能實施。若簡單選用一個LED光源照射，就會存在因點光源近距離投射造成不同位置光照度相差較大。為此，綜合考慮箱體大小、大鼠活動性，采用由9個藍光LED燈構成面陣照射，通過國家計量質檢中心檢測驗證，實時測量養殖箱底部5個部位(4個角+1個中心)的照度數值基本一致，波動范圍均在10%以內，符合實驗照射要求，可重復操作性強。本實驗設計方案既往未見國內外報道。

本實驗基于455～470nm面陣藍光發光器每天分別照射SD大鼠3、6、12h，隨藍光照射時間延長，各實驗組大鼠眼脈絡膜纖維結締組織玻璃樣改變，局部疏松水腫，小血管增生，色素層變薄，細胞稀疏，視細胞數逐漸減少，局部消失。3h實驗組細胞核染色清晰，雙極細胞層及節細胞層未見明確改變。6、12h實驗組細胞核固縮，雙極細胞層輕度增生，神經節細胞層局部形成胞突。光照時間越長光感受器細胞損傷越重，與既往報道一致。藍光照射引起視網膜色素上皮細胞變薄疏松，色素上皮細胞損傷程度與藍光照射時間無明顯關系。由于條件限制未對大鼠視網膜各層具體厚度及細胞數進行檢測及統計學分析，有待進一步完善。

致謝重慶市中醫研究院病理科曾敏指導病理切片閱片。