燈盞花素通過調節Bcl-2和Bax表達拮抗高糖誘導的RPE細胞損傷

劉海峰，趙永厚，高 源

0引言

糖尿病的發生是在遺傳的基礎上，糖尿病患者體內長期高血糖狀態導致多元醇代謝通路異常，蛋白激酶C激活，糖基化血紅蛋白和多元醇代謝產物因機體代謝障礙而逐漸堆積，氧化應激增強、細胞因子失衡等多因素共同參與、互相作用，破壞了視網膜生理屏障并啟動了氧化應激損傷[1-2]。燈盞花素(scutellarin)主要活性成分是燈盞乙素，具有抑制炎癥反應、減輕組織水腫、改善微循環、抗氧化、擴張血管的作用[3]。本研究通過構建高糖條件下視網膜色素上皮(retinal pigment epithelial，RPE)細胞氧化損傷模型，探討燈盞花素對RPE細胞的保護作用和機制。

1材料和方法

1.1材料燈盞花素(美國Sigma公司，純度>99%)，人RPE細胞(美國ATCC公司)，DMEM/F12(1∶1)培養基(武漢博士德生物工程有限公司)，CCK-8試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)， H2DCFDA熒光探針(江蘇凱基生物公司)，Hoechst 33258染色試劑盒(北京百奧萊博公司)，Bcl-2和Bax抗體(上海碧云天生物技術有限公司)。

1.2方法

1.2.1 RPE細胞的培養選取加入青-鏈霉素和10%胎牛血清的DMEM/F12作為培養基，37℃、飽和濕度、5% CO2培養箱中進行RPE細胞培養(本實驗中的RPE細胞為傳代第6代)。

1.2.2 RPE細胞分組依據燈盞花素濃度不同，分為四組：對照組RPE細胞以正常培養液(葡萄糖濃度為5.5mmol/L)孵育36h；高糖組RPE細胞培養液內葡萄糖濃度為30mmol/L，細胞孵育時間為12h[4]；燈盞花素低濃度組先以1μmol/L燈盞花素孵育細胞24h，PBS沖洗細胞3次，以換液方式在葡萄糖濃度為30mmol/L的培養液繼續孵育12h；燈盞花素高濃度組先以10μmol/L燈盞花素孵育細胞24h，PBS沖洗細胞3次，以換液方式在葡萄糖濃度為30mmol/L的培養液繼續孵育12h。

1.2.3細胞劃痕實驗觀察RPE細胞的遷移性以1×105/mL的密度將RPE細胞接種到6孔板，按上述方法處理細胞并分組，待細胞貼壁融合后24h，用2μL加樣槍頭比著直尺在培養板中間垂直劃痕，PBS沖洗劃下的細胞，加入無血清的DMEM/F12繼續培養，在48h時間點進行取樣、拍照記錄。實驗重復3次。

1.2.4 CCK-8法測定細胞增殖RPE細胞培養于96孔板內，每孔200μL，細胞密度為1×105個/mL，按實驗分組處理，棄去原有培養液，將已配制含10% CCK-8的培養基以換液的形式加入，接種后的96孔板37℃培養箱中繼續培養4h，用480nm吸光度進行檢測。

1.2.5流式細胞技術檢測RPE細胞內活性氧表達用不含EDTA的胰酶消化RPE細胞后制備細胞懸液，1 000r/min離心5min并收集細胞，預冷的PBS洗滌細胞3次，收集細胞并用100μL緩沖液重懸細胞，加入5μL Annexin-V和10μL PI，輕輕混勻，避光反應10min后再次加入100μL緩沖液，1h內用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.6細胞凋亡的形態學觀察細胞經相應處理后用PBS洗滌細胞2次，4%多聚甲醛固定細胞10min后PBS充分沖洗固定液，加入2μL Hoechst 33258染色液，避光反應10min后PBS充分沖洗，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.7 Western Blot檢測Bcl-2和Bax蛋白表達水平收集細胞并提取總蛋白，10 000r/min離心10min后取上清，行10% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉膜后5%脫脂奶粉4℃封閉2h，加羊抗兔多克隆一抗(稀釋濃度1∶1 000 )過夜，室溫下孵育鼠抗羊二抗(稀釋濃度1∶2 000)1h，ECL化學發光法自顯影并采集圖像，觀察Bcl-2和Bax的Western Blot條帶變化。

2結果

2.1細胞劃痕實驗檢測高糖下RPE細胞的遷移性四組RPE細胞遷移率比較，差異有統計學意義(P<0.05，表1)。拍照記錄可見，對照組RPE細胞形態規則，48h后劃痕仍清晰可見；高糖組培養的RPE細胞劃痕在48h時基本消失，且細胞狀態不佳，死亡和變形細胞增加，高糖組RPE細胞遷移率與對照組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；燈盞花素低濃度組和燈盞花素高濃度組RPE細胞形態較高糖組改善(圖1)，細胞遷移率較高糖組增加，與高糖組比較差異均有統計學意義(P<0.05)，其中燈盞花素高濃度組RPE細胞遷移率與燈盞花素低濃度組RPE細胞遷移率比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2燈盞花素對RPE細胞活力的影響四組RPE細胞存活率比較，差異有統計學意義(P<0.05，表1)。對照組RPE細胞存活率與高糖組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。1、10μmol/L燈盞花素孵育RPE細胞后，細胞存活率分別提高到61.06%±5.59%和79.81%±7.04%，與高糖組比較差異有統計學意義(P<0.05)；燈盞花素高濃度組RPE細胞存活率與燈盞花素低濃度組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.3 RPE細胞內ROS的變化以細胞數為縱坐標，相對熒光強度為橫坐標，可測定活細胞ROS的相對表達量。檢測結果顯示，四組RPE細胞內ROS變化比較，差異有統計學意義(P<0.05，表1)。對照組ROS主峰位于基線左側，細胞內ROS表達較低；高糖組ROS主峰向基線右側移位，細胞內ROS表達增加；1、10μmol/L燈盞花素干預后，RPE細胞內ROS主峰逐漸向基線左側移位，細胞內ROS表達逐漸降低(圖2)；燈盞花素高濃度組RPE細胞內ROS相對表達量與燈盞花素低濃度組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖1RPE細胞劃痕實驗(×200)A：對照組；B：高糖組；C：燈盞花素低濃度組；D：燈盞花素高濃度組。

圖2流式細胞技術檢測RPE細胞內ROS改變A：對照組；B：高糖組；C：燈盞花素低濃度組；D：燈盞花素高濃度組。

圖3燈盞花素對高糖誘導RPE細胞凋亡的影響(箭頭示凋亡細胞)(×200)A：對照組；B：高糖組；C：燈盞花素低濃度組；D：燈盞花素高濃度組。

組別細胞遷移率(%)細胞存活率(%)ROS熒光強度細胞凋亡率(%)Bcl-2Bax對照組103.03±4.11102.44±5.641.12±1.321.60±0.990.79±0.160.69±0.12高糖組44.21±4.67a40.63±4.72a100.55±3.44a55.43±7.67a0.13±0.10a1.03±0.13a燈盞花素低濃度組59.50±4.03a,c61.06±5.59a,c76.88±6.62a,c36.34±6.03a,c0.16±0.13a0.95±0.15a燈盞花素高濃度組71.84±3.39a,c,e79.81±7.04a,c,e33.26±4.11a,c,e21.08±5.49a,c,e0.55±0.16a,c,e0.73±0.09c F102.3097.5786.99105.32100.5972.55P<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05<0.05

注：aP<0.05vs對照組；cP<0.05vs高糖組；eP<0.05vs燈盞花素低濃度組。

2.4燈盞花素對RPE細胞凋亡的影響四組RPE細胞凋亡率比較，差異有統計學意義(P<0.05，表1)。在Hoechst 33258染色劑作用下，活細胞細胞核呈彌散均勻熒光，凋亡細胞的細胞核或細胞質呈現致密濃染的顆粒狀高熒光。熒光顯微鏡下，對照組背景熒光暗黑色，細胞核均勻染色，未見明顯凋亡細胞；高糖組部分細胞核呈致密濃染的亮藍色高熒光；1、10μmol/L燈盞花素處理后凋亡細胞數量逐漸減少(圖3)，燈盞花素高濃度組細胞凋亡率與燈盞花素低濃度組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.5 Bcl-2和Bax蛋白表達水平檢測四組RPE細胞中Bcl-2和Bax蛋白表達水平比較，差異有統計學意義(P<0.05，表1，圖4)。Bcl-2蛋白在高糖組中的表達明顯降低，與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)。低、高濃度燈盞花素組Bcl-2蛋白表達逐漸升高，其中高濃度燈盞花素組Bcl-2蛋白表達與高糖組比較，差異有統計學意義(P<0.05)；燈盞花素高濃度組Bcl-2蛋白相對表達量與燈盞花素低濃度組比較，差異有統計學意義(P<0.05)。Bax蛋白在高糖組中的表達明顯升高，與對照組相比差異有統計學意義(P<0.05)；燈盞花素干預可降低Bax蛋白的表達，其中高劑量燈盞花素組Bax蛋白表達的相對表達量與高糖組相比，差異有統計學意義(P<0.05)。

圖4燈盞花素對RPE細胞內Bcl-2和Bax表達的影響。

3討論

隨著糖尿病的進展，其并發癥開始出現，如糖尿病視網膜病變、周圍神經病變、糖尿病腎病、糖尿病足潰瘍、心血管疾病等[5]。其中，糖尿病腎病和視網膜病變是慢性高血糖引起的主要微血管并發癥，其發生原因與晚期氧化應激的誘導、促炎微環境的建立以及糖基化終產物增多有關[6-7]。

有研究顯示，燈盞花素在治療糖尿病腎病和周圍神經病變方面均有療效，其作用機制與降低組織氧化應激水平、抑制炎癥反應和調節血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)的表達有關[8-9]。在眼部，有學者采用霧化燈盞花素注射液方法治療糖尿病視網膜病變，發現該方法具有延緩糖尿病視網膜病變進程、改善患者視功能和提高生活質量的作用。此外，燈盞花素注射液在治療中心性漿液性脈絡膜視網膜病變、視網膜中央靜脈阻塞方面均有臨床療效[10-11]。關于燈盞花素對RPE細胞保護作用的研究并不多見，國內學者王競男等[12]通過建立大鼠糖尿病模型，觀察燈盞花素對大鼠視網膜組織中VEGF表達的影響，結果顯示燈盞花素可以有效降低VEGF表達，從而推測燈盞花素可以延緩糖尿病視網膜病變病程。

有學者對糖尿病大鼠視網膜進行深入研究，結果顯示過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、谷胱甘肽還原酶和超氧化物歧化酶表達明顯下調，而超氧化物明顯增加，說明糖尿病大鼠視網膜組織氧化應激程度明顯增加[13-14]。本實驗使用30mmol/L濃度的葡萄糖建立了RPE細胞高糖氧化應激模型，結果顯示30mmol/L濃度的葡萄糖引起RPE細胞活力降低，給予1、10μmol/L燈盞花素作用后，細胞活力增加。

H2DCFDA是一種可滲透細胞的熒光探針，用于檢測細胞內的ROS生成。本實驗采用流式細胞技術觀察高糖對RPE細胞的氧化損傷程度，結果顯示高糖對RPE細胞氧化損傷有明顯刺激作用，燈盞花素有效抑制了RPE細胞內ROS含量。

Hoechst 33258染色劑能與細胞核DNA結合并呈現藍色熒光。凋亡的細胞核濃染，熒光增強，呈致密顆粒和(或)塊狀高熒光；非凋亡細胞呈暗藍色低熒光。本實驗中，高糖組中亮藍色熒光明顯增多，證實高糖可以誘發RPE細胞凋亡，燈盞花素低劑量組和燈盞花素高劑量組中凋亡細胞比例逐漸降低。

Bcl-2在氧化應激介導的細胞凋亡反應中起重要作用，是調節線粒體凋亡途徑的重要分子，具有潛在的抗凋亡作用[15]。Bax表達水平的高低直接反映細胞凋亡程度，Western blot結果顯示，高糖組細胞中Bcl-2蛋白表達明顯降低，Bax蛋白表達明顯增加，提示高糖誘導了RPE細胞凋亡，燈盞花素通過改變Bcl-2和Bax蛋白的表達發揮抗細胞凋亡作用。

綜上所述，燈盞花素能夠有效抑制高糖誘導的RPE細胞凋亡，為糖尿病視網膜病變的治療靶點研究提供了理論支持。